梅花鹿鹿角盘蛋白的分离纯化及其对大肠杆菌抑菌机制的初步研究 药学专业.docVIP

摘 要 鹿角盘也称鹿花盘、鹿角帽，一般是鹿茸被锯根部残留骨化后于次年春天自然脱落的残角，常见于梅花鹿和马鹿，因其形状如盘而得名。早在汉代中医四大著作之一的神农本草经中就有关于鹿角盘的记载。《本经》：其主恶疮痈肿，逐邪恶气，留血在阴中。可经水煎熬浓缩成鹿角胶，起到滋补肝肾的功效，与鹿茸相比效果稍逊，但相较于鹿角而言具有奇效。鹿角盘具有有益身心、化瘀等功效，在医疗、保健、入药等多个领域作用广泛。因此对于鹿角盘更加深入的研究有利于鹿角盘产业的开发。鹿角盘主要功能成分之一引起了我们的关注，它就是蛋白质，生命物质基础和机体细胞组织的重要组成部分。所以，这次课题的切入点使蛋白质，在鹿角盘寻找生物活性蛋白，并对它的作用机制进行第一步研究，旨在为鹿角盘这一珍贵的动物药材的开发利用提供数据支持。 本实验采用水溶液冷提法、Sephadex G-25凝胶除盐等一系列方法得到梅花鹿鹿角盘总蛋白除盐品，对鹿角盘总蛋白除盐品进行Sephacryl S-100凝胶过滤层析分离得到具有抗菌活性的蛋白组分，再进一步利用反相高效液相层析技术分离得到相应的抗菌蛋白，分别运用以下方法对鹿角盘总蛋白及抗菌蛋白进行鉴定和分析：SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）电泳检测分子量分布、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、反向高效液相等；根据实验室前期抑菌活性实验的工作基础选取大肠杆菌为实验菌株，微量肉汤二倍稀释法测定鹿角盘蛋白的抑菌效果，确定总蛋白和抗菌蛋白最小抑菌浓度；在此基础之上，运用纸片扩散法更为直观的观察其抑菌程度。利用流式细胞仪和扫描电子显微镜等测定对大肠杆菌细胞膜渗透性、细胞壁完整性和对菌体氧化应激的影响。 结果表明：鹿角盘总蛋白除盐后蛋白含量为90.3％，经Sephacryl S-100HR凝胶层析获得分子量＜20.1kDa的蛋白组分S2对大肠杆菌具有抑菌活性，将S2（＜20.1kDa）组分通过反相高效液相得到抗菌蛋白18.963kDa，纯度为87.12％。抗菌蛋白在浓度为5mg/mL时对大肠杆菌具有最小抑菌浓度，抑菌圈直径为10.8±0.2mm达到中敏；处理组在一定时间内电导率、β-半乳糖苷酶活性的显著差异表明细胞膜通透性受损；扫描电镜发现抗菌蛋白作用后菌体出现变形、塌陷、皱缩、破碎，荧光显微镜观察PI单染处理组荧光强度增强，说明抗菌蛋白破坏了大肠杆菌细胞膜细胞壁的完整性；菌体经2MIC抗菌蛋白处理2h，流式细胞仪检测ROS表达量为69.3％，显著提高菌体氧化应激水平，从而对大肠杆菌起到一定的抑制作用。 关键词：鹿角盘；蛋白；分离纯化；大肠杆菌；抑菌机理 Abstract Antler plate is the bone part left after the antler of sika deer or red deer was sawed off. It will fall off naturally when the antler grows out in the next spring. Because of its shape, it is called antler plate or deer tray.As early as in the Han Dynasty, one of the four major works of Chinese medicine, there is a record of antler disc in the Shennong Materia Medica Classic.The Sutra : its main evil sores, carbuncle, chase evil gas, leaving blood in the Yin.It can be condensed into antler glue through water, which has the effect of nourishing liver and kidney, adding essence and stopping bleeding. It is not as strong as antler, but it is better than antler.The remaining bone residue is antler cream, which has the effect of warming kidney and helping Yang, astringency and hemostasis.Antler disc is widely used in the treatment of mastitis, mammary gland hyperplasia, gynecological inflammation, en