新型分离技术43高效液相色谱仪.pptxVIP

4.4 高效液相色谱仪 (HPLC);4.4.1 高效液相色谱仪类型 根据用途分类主要有(三类): 分析型、 制备型 专用型。 ;3;4;4.4.2 高效液相色谱仪组成 ;（1）高压输液系统 ;a 贮液器 贮液器用于存放溶剂。 溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐蚀，对溶剂呈惰性。 贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。 溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，空隙大小一般为2mm。;b 脱气装置 脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测。;c 高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪的重要部件，是驱动溶剂和样品通过色谱柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响分析结果的可靠性。;对高压泵的基本要求： ①流量稳定； ②输出压力高，最高输出压力为50MPa；③流量范围宽，可在0.01～10ml／min范围任选； ④耐酸、碱、缓冲液腐蚀； ⑤压力波动小。 ;梯度洗脱 利用两种或两种以上的溶剂，按照一定时间程序连续或阶段地改变配比浓度，以达到改变流动相极性、离子强度或pH值，从而提高洗脱能力，改善分离的一种有效方法。;当一个样品混合物的容量因子是范围很宽，用等度洗脱时间太长，且后出的峰形扁平不便检测时，用梯度洗脱可以改善峰形、并缩短分离时间。;HPLC的梯度洗脱与GC的程序升温相似，可以缩短分析时间，提高分离效果。 使所有的峰都处于最佳分离状态，而且峰形尖而窄。;（2）进样器 ;（3）分离系统 ;色谱柱按内径不同可分为常规柱、快速柱和微量柱三类。 ? 常规分析柱柱长一般为10-25cm，内径4- 5mm，固定相颗粒直径为 5-10 μm。为了保护分析柱不受污染，一般在分析柱前加一短柱，约数厘米长，称为保护柱。 （微量分析柱内径小于l mm，凝胶色谱往内径3～12 mm，制备往内径较大，可达25 mm以上。） ;（4）检测系统 ;1）紫外可见吸收检测器（ultraviolet－visible detector，UVD） ;其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。 紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装???流通池的紫外可见光度计。;（a）紫外吸收检测器 ;当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。;局限： 流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做 流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下， 因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长 。;（b）光电二极管阵列检测器（photodiode array detector， PDAD） ;采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸收值(A)是保留时间(tR)和波长(l)函数的三维色谱光谱图。 可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。;下图是单光束二极管阵列检测器的光路图。光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光栅色散成多色光，射到阵列元件上，使所有波长的光在接收器上同时被检测。 阵列式接收器上的光信号用电子学的方法快速扫描提取出来，每幅图象仅需要10ms，远远超过色谱流出峰的速度，因此可随峰扫描。 ;;2)荧光检测器（fluorescence detector， FD） ;近年来，采用激光作为荧光检测器的光源而产生的激光诱导荧光检测器极大地增强了荧光检测的信噪比，因而具有很高的灵敏度，在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。 ;3)示差折光检测器（differential refractive Index detector， RID） ;光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。 只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。 ;4)电化学检测器 （elec chemical detector， ED） ;电化学检测器的优点：;5)化学发光检测器 （c.iluminescence detector， CD） ;由于物质激发态的能量是来自化学反应，故叫作化学发光。 当分离组分从色谱柱中洗脱出来后，立即与适当的化学发光试剂混合，引起化学反应，导致发光物质产生辐射，其光强度与该物质的浓度成正比。 ;这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要有恒流泵，将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物