实验室做细胞常用的细胞固定及染色方法(详细)(学习资料).doc

学习资料-一页眉页脚可删除 实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法 一、 爬片前盖玻片处理方法 对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞 在长时间的染色过程中不从载玻片脱落， 必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻 片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。 能促进细胞黏附 的物质主要有多聚赖氨酸、铬矶明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、 将载玻片用玻璃专用洗涤剂（如Decon）浸泡5min,间或振荡。 2、 用自来水冲洗5min。 3、 以1 %盐酸一70%乙醇溶液浸泡5min。 4、 烤箱干燥（至此即可用于普通染色）。 5、 多聚L-赖氨酸（1:10溶于去离子水）浸泡5min,振荡。 6入60C烤箱1h,或室温过夜干燥（用于细胞化学、免疫细胞化学及原位 杂交细胞化学）。 二、 细胞固定常用方法 固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来， 避免 组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性， 防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并 在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。 同时，固定还可使细胞的各部 分易于着色，适于观察、长期保存和分析。 1. 固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对 象、目的和要求选择固定剂和固定方法。 2. 培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬 液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。 对双盖片悬滴培养物 和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞， PBS漂洗2〜3次后，备固定制片； 对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后， PBS液漂洗2〜3次，以 洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。 3. 常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液， 称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、 重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇（锇酸）。另一类是用两种或两种以上化学  固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、……学习资料…一页眉页脚可删除…… 不同的固定液对细胞的化学成分、 酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合 适的固定液是达到固定目的的基础。 (1) 4 %甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含 40%甲醛。在 很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。 4%甲醛-PBS使组织变硬速度 比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料 可用苏木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强 组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体 的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用 40%甲醛水溶 液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。 (2) 丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮(4 C)固定细胞内酶效果较佳。 (3) 乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细 胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固 定液。乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的适宜 浓度为70%〜100%。乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。 ⑷ 醋酸：常用0.3 %〜5%浓度的醋酸作固定剂。醋酸能和水及乙醇、甲醇 溶合，醋酸不固定蛋白质，但能固定核酸。醋酸的穿透力很大，它对细胞的膨胀 作用显著，这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合， 所以，常用醋酸来减少其 他固定剂引起的细胞收缩。细胞学技术中，它能防止细胞收缩，并能较好地 保存染色体，还能把染色质沉淀成为可染色的块状体。 (5) 苦味酸：苦味酸是黄色结晶体，强酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯， 在水中的溶解度可因水温变化而变化。 苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、 组蛋白和核酸。苦味酸的穿透力很慢，单独使用时，造成组织严重收缩。它和其 他药物混合配制时，可以作为蛋白质的沉淀剂，同时可避免组织收缩、硬化，而 且易于染色。所以在很多混合固定液中被广泛采用。 作固定用的最适浓度为1%。 (6) 锇酸(四氧化锇):锇酸是一种强氧化剂，不能同乙醇和甲醛混合使用。 它的挥发性很强，挥发出来的气体能固定结膜，对眼睛很有害，所以操作时应特 别注意。四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一， 配制时先在棕色试剂瓶中 盛入50〜100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0〜7.4)，再将装有1g锇酸的安培瓶 放人PBS中，以玻棒击碎安培瓶，摇荡使锇酸溶解，备用。常用的固定液浓度为 1%〜2%。 (7) 戊二醛：戊二醛对组织的渗透率高，与蛋白质反应快，能较好地保存蛋 白质，对微管