分子生物学研究法.ppt

聚丙烯酰胺凝胶电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离与纯化。变性的DNA在凝胶中的迁移率几乎与碱基组成及序列完全无关。 主要用途包括放射性DNA探针的分离、S1核酸酶消化产物的分析和DNA测序反应产物的分析。 用于双链DNA片段的分离和纯化。 主要用途为制备高纯度的DNA片段和检测蛋白质-DNA复合物。 五、 PCR技术 ◆PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。Kary Mullis发明的技术。 ◆三个过程 变性(denaturation): 通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单链DNA 。 退火(annealling)：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。 延伸(extention):在DNA聚合酶(Taq酶)和4种脱氧核苷酸（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）及Mg2+存在条件下, 聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应5`-3`方向 PCR的反应原理 ◆PCR反应体系 上下游引物(10-50pmol) 缓冲液(pH 8.3) Mg2+(0.5-2.5mM) dNTPs (0.2mM) Taq DNA聚合酶(2.5U) DNA模板(1ng) ◆PCR循环的主要参数 预变性：92℃-95℃， 2-5min 变 性：92℃-95℃，30s-1min 复 性：40℃-60℃，20s--2min 延 伸：70℃-75℃，30s--3min 循 环：30-40次 总延伸：72℃，7min ◆ PCR技术的特点 高度敏感性 高度特异性 操作简便 适用广泛 引物设计原则 ◆长度在15-30 bp，GC含量在40-60 %之间。上下游引物GC含量不能相差太大。引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低 Tm=4(G+C)+2(A+T) ◆ 3’不能与引物内部互补，以免形成二级结构 ◆ 引物3’端尽是不要选择A ◆ 碱基要随机分布 ◆两个引物各自的3’不能互补,以免形成自身扩增 ◆引物必须具有特异性 DNAStar分析 ◆ PCR的主要用途 目的基因的克隆 利用特异性引物； 利用简并引物 基因的体外突变 采用随意设计的引物,在体外对基因进 行嵌合、缺失、点突变等改造 基因表达分析 DNA的微量分析检测 个人识别 亲子鉴定 PCR定点诱变 逆转录PCR(RT-PCR) mRNA cDNA PCR Oligo dT, 逆转录酶 特异性引物, Taq酶 用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达 荧光定量PCR 基因表达的绝对定量分析 基因表达的相对定量分析 定量PCR和Array技术的结合 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 ? 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB (一)荧光定量PCR的原理 内掺式染料 SYBR Green I, SYTO 9 , Eva Green, LC Green 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons FRET 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 荧光定量 PCR 标记方法 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission 内掺式染料 SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 内掺式