分子克隆基本流程及技术原理.pdfVIP

分子克隆主要技术： （1）限制性内切酶酶切与连接 基因克隆也叫 DNA 分子克隆，即在体外重组 DNA 分子，而实现该技术的 关键是一种被称作限制性核酸内切酶的工具酶。 每一种限制性核酸内切酶可以 识别 DNA 分子上特定的碱基序列，切断 DNA 分子。依据碱基互补的原理，在 DNA连接酶的作用下可以把切开的 DNA 片段连接起来，因此可以把目的片段 连接到合适的载体上形成重组子。 （2 ）转化与转染 作为表达载体， 必须具有复制起始序列、 多克隆位点及选择标记， 可以在 宿主细胞中进行自我复制或整合到宿主基因组中进行复制。 作为宿主的工程菌 或细胞在某些化学条件或物理刺激下会改变其细胞膜的通透性， 从而易于将细 胞表面附着的外源基因吸收到胞内， 这一过程即转化 （工程菌）或转染 （细胞）。 利用选择标记可以很容易鉴别成功导入目的基因的工程菌或细胞， 比如抗 生素抗性筛选—凡是成功导入重组载体的工程菌或细胞均获得某种抗生素抗 性，而未导入的工程菌或细胞则不能在含该抗生素的培养基中生长。 （3 ）聚合酶链式反应 聚合酶链式反应， 即 PCR。PCR技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过 程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火-- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 94℃左 右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA 解离，使之成 为单链，以便它与引物结合， 为下轮反应作准备； ②模板 DNA 与引物的退火 (复 性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃（具体退火温度根据引物 的Tm值确定）左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延 伸： DNA 模板 -- 引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料， 靶序列为模板， 按碱基互补配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链， 重复循环变性 --退火--延伸三过程就可获得更多的 “半 保留复制链 ”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需 2～ 4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 整个分子克隆从设计引物开始， 根据需要拿到的目的蛋白相应地 核酸序列， 设计出含有酶切位点及所需 Tag 的特异性引物， 至于设计 引物的原则，可以从网上、书上查到，这里不再赘述。以下框架图给 出了分子克隆的基本流程： PCR扩增目的基因 提取载体质粒 限制性内切酶双酶切 限制性内切酶双酶切 DNA连接酶连接目的片段和载体 制备感受态细胞 转化感受态细胞 转化的细胞铺抗性平板 从平板上挑取单菌株， 37℃培养 菌液 PCR或抽提质粒酶切、 PCR鉴定单阳性克隆