基因工程(基因工程的基本条件载体系统).pptx

争花不待叶， 密缀欲无条。 傍沼人窥鉴， 惊鱼水溅桥。《桃花》生物技术专业核心课程基 因 工 程淮阴师范学院 杨文杰4基因工程的基本条件A 用于核酸操作的工具酶B 用于基因克隆的载体C 用于基因转移的受体菌或细胞质粒载体载体的功能及特征噬菌体载体粘粒载体人工染色体载体第二节 基因工程的载体系统一、克隆载体(一)载体的功能及特征载体的概念载体: 在基因克隆中携带外源基因进入受体细胞的基因工程“运载工具”称为载体。载体的化学本质是DNA。目前基因工程中使用的载体多为经过改造的质粒DNA。载体应具备的基本特性：1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)； 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；4.具有较高的外源DNA的载装能力；5.具有合适的筛选标记。1. 质粒的一般生物学特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；质粒常见于原核细菌和真菌中；绝大多数的质粒是DNA型的；绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分 子结构，即cccDNA；质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。(二)质粒载体(Plasmid)2. 质粒的分类F质粒：又叫F因子或性质粒，它们能使寄主染色体上的基因和F质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞。R质粒：通称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且能够将此抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。Col质粒：即所谓产生大肠杆菌素因子，它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。3. 质粒的基本特性（1）自主复制（2）不相容性（3）转移性（4）编码性状（1）自主复制质粒DNA上都含有一个复制起始区，控制着质粒在宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子”。一般一个质粒DNA分子上只含有一个复制子。不同质粒在宿主内复制的程度相差较大，体现在单个细胞内的质粒拷贝数上，最多的可高达700个/细胞，最低的在每个细胞中只维持有一个质粒分子。拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合复制方向RNA II3’5’5’3’RNA Iorirop（+）RopE.coli ColE1 plasmid按复制能力可将质粒分为两种类型： 严紧型（Stringent plasmid): 低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-3个质 粒分子 松弛型（Relaxed plasmid): 高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可含高达10-60 个质粒分子（2）质粒的不相容性质粒的不相容性(Plasmid incom-patibility)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质粒。不相容性的质粒组成不相容性群,目前，在大肠杆菌质粒中至少已鉴定出了30个以上的不亲和群。（3）质粒的转移质粒的接合转移接合型质粒:能在自然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；非接合型质粒:不能在自然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。性须质粒的迁移作用质粒的迁移作用（Mobilization)：非接合型的质粒由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型的质粒引发的非接合型质粒的转移过程，如ColE1质粒。（4）编码性状野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有 机物；物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱。这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。4. 质粒载体的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由 少数几个野生型质粒构建的。pSC101：8.8 kb，拷贝数5，四环素抗性标记基 因 TcrColE1：6.5 kb，拷贝数20-30，大肠杆菌内毒素 标记基因 E1RSF2124：ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标 记基因 Apr多克隆位点(Multiple Cloning Sites, MCS)在质粒载体内引入适宜的限制性核酸内切酶位 点，以方便外源DNA片段的插入。现在几乎所有的载体都含有一个人工合成的密集排列的系列克隆位点，称为“多接头”、“限制酶切位点库”或“多克隆位点”。标记基因(Marker Gene