2021年DNA提取及PCR扩增实验报告.docVIP

PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳 1131428 环境科学 一、 试验目 1．学习并掌握PCR扩增基础原理与试验技术。 2．对扩增后DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验, 并分析对应结果。 二、 试验原理 1. PCR扩增 多聚酶链反应（PCR）技术原理类似于DNA天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液, 加入微量模板DNA、 四种脱氧核苷酸（dNTP）、 耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物, 以后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性, 双链解链, 这是所谓变性阶段。降低溶液温度, 使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链, 这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃）, 在Tap酶作用下, 用四种dNTP为原料, 引物为复制起点, 模板DNA一条双链在解链和退火以后延伸为两条双链, 这是延伸阶段。如此反复, 在同一反应体系中可反复高温变性、 低温退火和DNA合成这一循环, 使产物DNA反复合成, 并在反复过程中, 前一循环产物DNA可作为后一循环模板DNA而参与DNA合成, 使产物DNA量按指数方法扩增。经过30～40个循环, DNA扩增即可完成。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳试验 DNA分子在高于其等电点溶液中带负电, 在电场中向阳极移动。在一定电场强度下, DNA分子迁移速度取决于分子筛效应, 即分子本身大小和构型是关键影响原因。DNA分子迁移速度与其相对分子量成反比。不一样构型DNA分子迁移速度不一样。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物, 利用DNA分子在泳动时电荷效应和分子筛效应, 达成分离混合物目。 三、 试验材料 仪器: PCR扩增仪、 0.2ul薄壁管、 1.5ml离心管、 移液枪、 枪头、 微波炉、 电泳仪、 水平电泳槽、 制胶版、 紫外透射仪。 试剂: TapDNA聚合酶、 dNTP、 buffer、 两种引物、 16S全长DNA样本、 无菌ddH2O、 模板DNA 、 TBE、 琼脂糖、 EB、 显色剂。 试验步骤 1. PCR扩增 此次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。 1.1 依据计算, 首先取1.5ml离心管根据2.5ul 10×Buffer 、 1 ul dNTP、 0.5 ul 341GC、 0.5 ul 534、 0.125 ul Taq、 19.375u ddH2O百分比配置足量PCR反应体系。 1.2 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul反应体系, 并分别添加8种不一样模版, 并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。 1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中, 根据预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达成30~40次。程序以下: 预变性: 94℃ 3min 循环: 94℃ 变性30s 55℃ 72℃ 延伸 末次延伸: 72℃ 5min 1.4 PCR扩增完成后, 将样品取出并保留于15℃ 2. DNA琼脂糖凝胶电泳试验 2.1称取0.2g琼脂糖粉末, 放到一锥形瓶中, 加入适量0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化, 溶液透明。摇匀, 待冷却至60℃左右, 在胶液内加入适量EB 2.2 取有机玻璃制胶板槽, 在一端插好梳子, 在槽内缓慢倒入已冷至60℃ 2.3 待胶凝固后, 小心拔起梳子, 使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。 2.4 在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液, 至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测DNA样品混合后, 用移液枪滴加至凝胶加样孔中。 2.5 接通电泳仪和电泳槽, 并接通电源, 调整稳压输出, 电压最高不超出5V/cm, 开始电泳。点样端放阴极端。依据经验调整电压使分带清楚。 2.6 观察溴酚兰带（蓝色）移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处, 可停止电泳。 2.7 在紫外透视仪样品台上重新铺上一张保鲜膜, 赶去气泡平铺, 然后把凝胶放在上面。关上样品室外门, 打开紫外灯, 经过观察孔进行观察。 五、 试验结果与讨论 如图所表示: 从左至右, 分别是模版1-8号, 第9列为阴性对照。 前8列都有显著条带出现, 而阴性对照无显示, 说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线, 上面一条线所覆盖条带基础能够代表扩增产生片段位置, 参考图能够看出扩增片段在200bp左右。在第9个阴性对照第二条线处能够看到较为模糊条带, 并非是出现假阴性, 而是因为二聚物而产生条带。经过该条带与最右侧marker对比可知该片段出现在100bp左右, 并非因为试验操作等问题而产生污染。 试验照片显示试验结果有拖尾现象, 不过并不影响后续试验。在试验过程中因为有些试剂加到了管壁上面, 并没有完全加入, 可能会出现部分误差。另外在第1列条带中出现了其她亮带,