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2021年淀粉酶活性测定实验报告 2021年淀粉酶活性测定实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年淀粉酶活性测定实验报告 班级: 植物092 姓名: 徐炜佳 学号: 淀粉酶活性测定 一、 研究背景及目 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应活性蛋白, 几乎全部生化反应都离不开酶催化, 所以酶在生物体内饰演着极其关键角色, 所以对酶研究有着非常关键意义。酶活力是酶关键参数, 反应是酶催化能力, 所以测定酶活力是研究酶基础。酶活力由酶活力单位表征, 经过计算适宜条件下一定时间内一定量酶催化生成产物量得到 淀粉酶是水解淀粉糖苷键一类酶总称, 根据其水解淀粉作用方法, 可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最关键两种, 存在于禾谷类种子中。β-淀粉酶存在于休眠种子中, 而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成。 α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽一个生理指标,α-淀粉酶活性低品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。现在,相关α-淀粉酶活性测定方法很多个,活力单位定义也各不相同,中国外测定α-淀粉酶活性方法常见有凝胶扩散法、 3?,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法?。这3?种方法所用材料分别是新鲜种子、 萌动种子和面粉,取得α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内源)α-淀粉酶、 萌动种子α-淀粉酶和后熟面粉α-淀粉酶活性。 测定方法 优点 缺点 DNS 灵敏、 正确、 正确度高,适宜正确测量小样品α-淀粉酶活性大小 测定步骤较繁,不便分析大量样品,测定范围较窄 凝胶扩散法 简便、 快速、 省时、 省力,消耗材料和药品较少,不需要特殊仪器,测定范围较宽 边界不清楚,灵敏度与正确度较低,不宜正确测量α-淀粉酶活性大小 降落值法 快速、 省时、 重现性好、 平行性好、 消耗药品少,适宜于测量大量样品 消耗材料多,间接测定α-淀粉酶活性大小 本试验目在于掌握α-淀粉酶和β-淀粉酶提取和测定方法。 二、 试验原理 萌发种子中存在两种淀粉酶, 分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶, β-淀粉酶不耐热, 在高温下易钝化, 而α-淀粉酶不耐酸, 在pH3.6下则发生钝化。本试验设计利用β-淀粉酶不耐热特征, 在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶酶活性。 酶活性测定是经过测定一定量酶在一定时间内催化得到麦芽糖量来实现, 淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖, 可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定, 因为麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸显色基团, 将其颜色深浅与糖含量成正比, 故可求出麦芽糖含量。常见单位时间内生成麦芽糖毫克数表示淀粉酶活性大小。然后利用一样原理测得两种淀粉酶总活性。试验中为了消除非酶促反应引发麦芽糖生成带来误差, 每组试验都做了对应对照试验, 在最终计算酶活性时以测量组值减去对照组值加以校正。 在试验中要严格控制温度立刻间, 以减小误差。而且在酶作用过程中, 四支测定管及空白管不要混淆。 三、 材料、 试剂与仪器 试验材料: 萌发小麦种子（芽长1厘米左右） 仪器: 722光栅分光光度计(编号990695) DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056) 离心机(TDL-40B) 容量瓶: 50ml×1, 100ml×1 小台秤 研钵 具塞刻度试管: 15ml×6 试管: 8支 移液器 烧杯 试剂: ① 1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉, 加入80ml蒸馏水, 加热熔解, 冷却后定容至100ml）; ② pH5.6柠檬缓冲液: A液（称取柠檬酸20.01克, 溶解后定容至1L） B液（称取柠檬酸钠29.41克, 溶解后定容至1L） 取A液5.5ml、 B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液; ③ 3, 5-二硝基水杨酸溶液（称取3, 5-二硝基水杨酸1.00克, 溶于20ml 1M氢氧化钠中, 加入50ml蒸馏水, 再加入30克酒石酸钠, 待溶解后, 用蒸馏水稀释至100ml, 盖紧瓶盖保留）; ④ 麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖, 溶于少许蒸馏水中, 小心移入100ml容量瓶中定容）; ⑤ 0.4M NaOH 四、 试验步骤 1. 酶液制备 称取2克萌发小麦种子与研钵中, 加少许石英砂, 研磨至匀浆, 转移到50ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度, 混匀后在室温下放置, 每隔数分钟振荡一次, 提取15-20分钟, 于3500转/分离心20分钟, 取上清液备用。 2.α-淀粉酶活性测定 ① 取4支管, 注明2支为对照管, 另2支为测定管 ② 于每管中各加酶提取液液1ml, 在70℃恒温水浴中（水浴温度改变不应超出±0.5℃）正确加热15min, 在此期间β- ③ 在试管中各加入1ml柠檬酸缓冲液 ④ 向两支对照管中各加入4ml 0.