植物总RNA的提取与电泳.pptVIP

1. 实验目的和要求 掌握RNA制备以及常用鉴定方法的原理、操作步骤、注意事项和技术关键。;2. 相关基础知识;由于RNase极稳定，所以，在操作RNA时，要格外仔细，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必须对所用器皿进行RNase灭活处理。如用180oC干烤8小时以上处理玻璃器皿，或用0.1?的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用0.1? DEPC水处理，但Tris-Cl缓冲液等不可以用DEPC处理。 注意：DEPC有致癌之嫌 ，必须小心操作，防止接触与吸入 ！;植物细胞内的RNA主要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和 mRNA（占1～5％）。rRNA含量最丰富，由25S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端都有一个polyA尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)层析柱从总RNA中将 mRNA分离出来。一般情况下，提取的总RNA也可用于Northern blot试验。;;提取植物RNA时，要注意的问题： 1）一般用机械研磨的方法破碎植物 组织细胞； 2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白 与RNA分离并释放出RNA； 3）抑制内源和外源RNase活性； 4）将RNA与DNA、蛋白质及其它细 胞成分分开。;苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA； 胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和?-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀； 氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。;本实验采用QIAGEN试剂盒，其原理是依据胍盐法。即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有RNase抑制剂，抑制RNase活性，保证RNA的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶液均质化，包括RNA在内的分子物质通过离心柱。加入乙醇后，再过第二个离心柱，RN A就结合在柱子底部有硅胶的膜上，洗去其它杂质，最后用无RNase的水溶出RNA。该柱子可结合100?g大于200bp的RNA，所以应控制起始材料的用量。;RNA的检测：;由于RNA分子是单链核酸分子，它不同于DNA的双链分子结构，其自身可以回折形成发卡式二级结构及更复杂的分子状态，以至通过一般传统的琼脂塘凝胶电泳难以得到依赖于分子量的电泳分离条带，为此电泳上样前将样品于65摄氏度加热变性5分钟，使RNA分子的二级结构充分打开，并且在琼脂糖凝胶中加入适量的甲醛，可保证RNA分子在电泳过程中持续保持单链状态，因此，总RAN样品便在统一构像下得到了琼脂糖凝胶上的依赖于分子量的逐级分离条带。;而且RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜的结合。 RNA通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，可以直观快捷的分析RNA质量之优劣，当有标准的“分子标尺”（marker）存在时，还可相对客观的对总RNA样品进行定性和定量。 为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。 ;3. 实验材料与试剂;4. 实验方法和步骤;;实验步骤 （每一步均要求无RNase污染） ① 称取新鲜材料100 mg，液氮速冻； ② 在预冷的研钵中并在液氮中将材料 研磨成细粉末，转移到2ml或1.5ml 离心管中； ③ 待液氮挥发（但不能解冻）后，加入 450 μl提取缓冲液RLT，混匀后在 56℃下温育1～3min；;④ 将裂解液加到离心柱（淡紫色）上 下接一个2ml收集管，最大转速离心 2min。裂解液通过柱子时被均质化 小心吸取上清液，转移到另一新离 心管； 加入0.5倍体积（225 μl）96～100% 乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能 会出现沉淀，无影响； ;将混合液全部（包括沉淀675 μl） 转移到吸附离心柱（粉红色）内， 下接2 ml的收集管，10000 rpm离心 15秒。弃去管内液体； ⑦加入700μl RW1缓冲液，10000rpm转速下离心25秒，弃去收集管； ⑧将离心柱转移到一个新的2ml收集 管上，加入500μl RPE缓冲液， 10000 rpm离心15秒，弃去管内液体 重复使用收集管；;加入500μl RPE到离心柱内，最大转速离心2min，干燥离心柱，弃去收集管； ⑩把离心柱接在一个新的1.5 ml Eppen管上，加入30～50μl 无RNase水（0.1%DEPC处理）