2021年质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告.docVIP

2021年质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告 2021年质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告 一、 试验名称: 质粒DNA提取与纯化, DNA琼脂糖凝胶电泳 二、 试验原理: 1.质粒DNA提取: 质粒是一类存在于几乎全部细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态双链、 闭环DNA分子, 能够自主复制和稳定遗传, 以超螺旋形式存在, 是最常见基因克隆载体。除质粒外, 大肠杆菌中还含有基因组DNA、 多种RNA、 蛋白质和脂质等物质, 所以需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA方法很多, 其中常见方法有碱裂解法、 煮沸法、 SDS法、 羟基磷灰石层析法等。在实际操作中能够依据宿主菌株类型、 质粒分子大小、 碱基组成和结构等特点以及质粒DNA用途进行选择。本试验使用碱裂解法, 即利用SolutionⅠ 、 Ⅱ、 Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理以下。 （1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理: 碱裂解法提取质粒DNA是依据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性差异来分离质粒DNA, 达成分离提纯质粒DNA目。在pH值高达12.6碱性条件下, 线性DNA因氢键断裂, 双螺旋结构解开而变性, 尽管在这么条件下, 共价闭环质粒DNA大部分氢键会被断裂, 但超螺旋共价闭合环状两条互补链相互缠绕, 不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时, 共价闭合环状质粒DNA复性, 恢复其天然构象, 以可溶状态存在于液相中; 而线性染色体DNA因为两条互补链相互已完全分开、 分子量大、 结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定大分子RNA、 变形蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。深入用酚、 氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质, 然后用无水乙醇沉淀, 即可取得纯化质粒DNA。SolutionⅠ 、 Ⅱ、 Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA具体作用和原理以下。 （2）四种溶液作用及原理: ①Solution I作用: 悬浮大肠杆菌菌体, 增加溶液粘度, 维持渗透压及预防DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子螯合剂, 在溶液I中加入EDTA, 是要把大肠杆菌细胞中二价金属离子都螯合掉, 从而起到抑制DNA酶对DNA降解和抑制微生物生长作用。另外也可确保溶菌酶活性。 ②Solution II作用: 提供碱性条件, pH高达12.6, 使大肠杆菌瞬间裂解, 促进染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠（SDS）可使细胞膜、 核膜发生破裂, 充足溶解膜蛋白。同时, 磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。 ③Solution III作用: 为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有高浓度钾离子与溶液体系中十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾, 从而将与之结合绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长基因组DNA一起沉淀, 与质粒分离开来; 另外溶液III所含有醋酸中和溶液Ⅱ强碱性, 使pH降至中性, 因为长时间碱性条件会打断DNA; 基因组DNA一旦发生断裂, 只要是50-100kb大小片段, 就没有措施再被PDS共沉淀, 这么就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA提取过程中, 沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、 低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、 在体系中溶解度降低, 较充足分离提纯出试验所需质粒DNA ④无水乙醇作用: 是试验中最常见沉淀DNA方法。DNA 溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围水分子,使DNA失水而易于聚合.通常试验中,是加2倍体积无水乙醇与DNA相混 合,其乙醇最终含量占67%左右。乙醇优点是能够任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,所以是理想沉淀剂。 也能够用0.6倍体积异丙醇选择性沉淀DNA。 2.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳: 利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时电荷效应和分子筛效应而达成分离、 判定DNA目。DNA分子在高于等电点pH溶液环境中带负电荷, 在电场中向正极移动。在一定电场强度下, DNA分子迁移速度取决于分子筛效应, 即DNA分子本身构型和大小。不一样分子因为所带电荷、 分子质量或者构型不一样, 在同一电泳系统中泳动速度不一样, 所以能够相互分离, 并检测起分子量大小。未切割质粒DNA在其泳道上可能会出现多个条带, 之所以这么是因为质粒DNA在琼脂糖凝胶中迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定。凝胶中DNA位置能够用低浓度荧光染料如溴化乙锭（EB）染色直接观察到, 甚至含量少至20?