sd大鼠骨髓间充质干细胞体外分离.pptxVIP

1;实验结果：;试验方法：;结论：;实验材料：;前言：;试验方法：1、鼠原代BMSCs的分离培养;2、大鼠BMSCs的传代与纯化;大鼠BMSCs生长曲线测定：;2、大鼠BMSCs P4细胞成骨、成脂诱导分化鉴定;大鼠BMSCs的鉴定：1、流式细胞仪鉴定;结果：1、大鼠原代BMSCs的分离培养;2、大鼠BMSCs的传代与纯化;3、大鼠BMSCs生长曲线测定;4、大鼠BMSCs的鉴定;讨论：;采用密度梯度离心法对细胞活性影响较小，却破坏了BMSCs生长的骨髓微环境，导致细胞增殖能力下降。桂莉等采用Percoll淋巴细胞分离液获得骨髓中的单个核细胞，并结合BMSCs的贴壁特性，获得大鼠BMSCs，虽然细胞均一性更高，但增殖速度较慢。高建鹏等比较贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠BMSCs的效果，发现贴壁培养法和密度梯度离心法都可以得到纯度较高的MSCs，两种培养方法的效果无明显差异。全骨髓贴壁培养法是根据BMSCs贴壁生长而造血细胞???浮生长的特性对两者进行分离，由于保存了BMSCs生长所需的骨髓微环境，细胞经换液传代后得到纯化且能保持旺盛的增殖能力。本实验采用全骨髓贴壁培养法成功分离培养出了纯度较高的BMSCs。每次换液去除悬浮生长的造血细胞；传代时利用BMSCs较淋巴细胞、单核细胞易脱落的特点，严格控制胰酶的用量和消化时间，使BMSCs在较短的时间内与培养瓶底分开，淋巴细胞、单核细胞则因贴壁性强仍贴附于培养瓶底，从而使BMSCs得到进一步纯化。随着换液传代次数的增加，BMSCs的纯度也不断增加。在体外分离培养BMSCs的过程中我们也体会到，造血系细胞对骨髓间充质干细胞的生物学特性影响很小，而且全骨髓贴壁培养法操作简单快速，造成污染的环节和机会较少，不需离心，可以更好的保持细胞活性。同时将全骨髓贴壁培养法作为其他培养方法的基础，为后续实验进一步富集BMSCs和进行单克隆培养提供良好的细胞来源。;BMSCs原代细胞对于细胞的接种密度依赖性很强，接种密度过稀，则细胞不能形成有效的相互作用而导致细胞增殖缓慢甚至完全停止生长。因此采用全骨髓贴壁培养法在原代接种时应尽可能获得足够多的骨髓液冲洗以达到BMSCs的良好增殖，我们的体会是将大鼠双侧股骨和胫骨的骨髓液一同冲洗后接种入一个25cm2的塑料培养瓶内以保证接种细胞的密度，与陈凯等报道一致。而赵玉金等则报道采用全骨髓培养获得原代大鼠BMSCs，传代后低密度接种结合机械擦除对所培养细胞进行纯化，可以获得高纯度大鼠BMSCs，且具有更佳的生物学特性。周丽娜等通过对照研究发现采用全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs，培养基内添加表皮生长因子后能够稳定、简便、快速获取大量高纯度大鼠BMSCs。;本研究针对性地观察了P1至P5BMSCs的生长特性，结果发现P5BMSCs增殖速度明显减慢，其细胞倍增时间也明显延长，提示大鼠BMSCs似乎不能在体外无限扩增。进一步研究发现，BMSCs随着传代次数的增加，逐渐出现衰老现象，传到第10代以后，细胞逐渐出现空泡或者折光性降低等改变，其体外增殖的能力也逐渐下降，表现在形态上从梭形或多角形逐渐变得宽大扁平，传代时间延长。而李宁等通过观察不同氧浓度微环境对间充质干细胞增殖的影响，发现适宜的高浓度氧微环境可以促进大鼠BMSCs的增殖。 ;迄今为止，仍然没有发现BMSCs公认的独特的抗原表型，一般采用联合的抗原表型来鉴定BMSCs。BMSCs不表达造血细胞表面抗原，如造血干细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45等，而表达CD29、CD90等间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志物。本研究分离到的细胞绝大部分表达CD29和CD90，不表达CD34和CD45，表明本实验获得的细胞为纯度较高的大鼠BMSCs。 多向分化潜能被认为是骨髓间充质干细胞的最重要的生物学特征。本实验培养的大鼠BMSCs在成骨诱导后，经茜素红染色发现，细胞间出现矿化结节，表明BMSCs已向成骨细胞分化。在成脂诱导后，经油红O染色发现，细胞内出现脂滴，呈典型脂肪细胞表型，表明BMSCs已向脂肪细胞分化。以上结果进一步证明我们所培养的细胞是具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞。; 本实验采用全骨髓贴壁培养法体外培养扩增大鼠BMSCs，简单、实用、高效，分离培养的大鼠BMSCs具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性，为下一步对大鼠BMSCs进行基因修饰及其体内移植奠定实验基础。;谢谢观赏!;实验材料：;2、大鼠BMSCs的传代与纯化;大鼠BMSCs的鉴定：1、流式细胞仪鉴定;迄今为止，仍然没有发现BMSCs公认的独特的抗原表型，一般采用联合的抗原表型来鉴定BMSCs。BMSCs不表达造血细胞表面抗原，如造血干细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45等，而表达CD29、CD90等间质细胞、内皮细胞和表