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2021年柱层析实验报告 2021年柱层析实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年柱层析实验报告 柱层析分离色素 一、 【试验目】 1．了解柱层析分类, 掌握多种柱层析原理。 2．熟练掌握吸附层析原理和操作技术。 二、 【试验原理】 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用关键物质, 关键有叶绿素a、 叶绿素b、 胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂特征, 可用95%乙醇或无水乙醇提取。 分离色素方法有多个, 如纸层析、 柱层析等。柱层析法是色谱法中一个, 它是依据混合物中各组分对固定相吸附能力, 以及对洗脱剂（即移动相）溶解度不一样将各组分分离。常见柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。 吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大, 经过活化多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶）, 当混合物溶液流经吸附柱时, 就被吸附在柱上端, 然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。因为不一样化合物在吸附柱上吸附能力不一样, 在同一溶剂中溶解度也不一样, 所以各组分随溶剂以不一样速度下移, 形成色带。继续用溶剂洗脱, 吸附能力最弱组分就随溶剂首先流出, 整个层析过程进行反复吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法能够分别搜集各组分, 并逐一判定。 本试验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂, 将叶绿体色素石油醚提取液倾于吸附柱上, 色素即被吸附。因为色素种类不一样, 被吸附强弱不一样, 就在吸附柱上排列成为不一样色层, 再利用吸附剂在不一样溶剂中有不一样吸附力, 用不一样溶剂进行洗脱, 从而达成叶绿体关键4种色素（叶绿素a、 叶绿素b、 叶黄素、 胡萝卜素）分离。 三、 【试验材料】 原料: 新鲜菠菜叶 试剂 : 1． 无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝 2． 石英砂 6．饱和氯化钠溶液 3． 丙酮 7.水硫酸钠 4． 石油醚（60-90℃） 8洗脱液: 丙酮: 石油醚＝1: 9 器材 : 层析柱（1×30cm）, 研钵, 蒸馏装置, 脱脂棉, 天平, 烧杯, 过滤漏斗, 玻璃棒, 锥形瓶, 分液漏斗, 试管 , 铁架台 四、 【试验操作】 1． 色素提取: 20克菠菜, 加少许石英砂, 再加20毫升无水乙醇研磨成浆, 脱脂棉过滤, 保留滤液, 滤渣再用无水乙醇提取一次, 合并滤液, 滤渣再加入30毫升石油醚提取一次, 过滤, 合并滤液, 转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡, 弃去下层溶液, 再分别加入20毫升水震荡洗涤几次, 直至下层无色, 保留上层溶液, 转移至三角瓶中, 加入无水硫酸钠干燥5分钟, 备用. 2．样品浓缩: 将提取液放入蒸馏烧瓶中, 蒸除多出石油醚, 至剩下液体5-8毫 升左右, 以备加样使用。 3．层析拄制备: 15克碱性三氧化二铝加入30毫升石油醚搅拌, 浸泡10min.。在层 析拄内加入一团棉花在底部, 再加入石英砂0.5cm以上, 然后用石油醚半充满柱子, 再将浸泡好三氧化二铝倒入柱内, 倒时应该缓慢, 反复使用下面石油醚, 直到装完。用石油醚洗柱内壁, 顶部加一小团棉花, 然后再填入石英砂0.5厘米高。 3．样品分离层析: 吸附层析分离色素 打开层析拄下部开关, 向拄内加入2毫升浓缩液, 至液体没入砂内, 再加入石油醚冲洗拄壁, 液体浸入砂内, 加洗脱液开始层析, 能够看到不一样色带如图片1, 直至第一条色带洗脱完成, 在拄下面用试管接收第一条色带洗脱液, 如图片2。 五、 【试验结果】 试验结果以下图: 图一: 层析柱中出现黄色带 图二: 提取出黄色胡萝卜素 结果分析: 洗脱过程中, 首先有一条黄色色带圈沿着层析柱下移, 色带圈各个方向移动速度并不是完全相同, 原因在于层析柱制作过程并不完全均一, 使层析柱内部不均匀, 以至于色带各方向移动速度不一样。最终搜集得到亮黄色胡萝卜素。 七、 【注意事项】 1、 萃取时不要猛烈振荡, 以预防发生乳化现象。 2、 为了保持柱子均一性, 使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必需, 不然当柱中溶剂或溶液流干时, 就会使柱身干裂, 影响渗透和显色均一性。所以要确保整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝表面。 3、 在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起; 在吸附柱下端加脱脂棉（或沙子）能够预防吸附剂细粒流出。 4、 层析柱填装紧密是否, 对分离效果很有影响, 若各部分松紧不匀, 会影响渗透速度和显色均匀。 6、 洗脱流速不宜过快, 避免所以压紧凝胶, 色素