过氧化氢酶CAT活性测定.pdfVIP

； 过氧化氢酶活性测定 紫外吸收法 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中， 其活性与植物的代谢强度及抗寒、 抗病能力 有一定关系，故常加以测定。 一、原理】 H2O2在 240nm 波长下有强烈吸收， 过氧化氢酶能分解过氧化氢， 使反应溶液吸光度 (A 240) 随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 【仪器与设备与试剂】 1 、材料 小麦叶片等。 2、仪器设备 研钵；离心机； 250ml 容量瓶；移液管（ 0.5ml 、2ml 各2支）；10ml 试管 3支；恒温水浴； 紫外分光光度计； 3、试剂 0.2mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含 1%聚乙烯吡咯烷酮） ； 0.1mol/L H 2O2 （用0.1mol/L 高锰酸钾标定） 。 【方法】 1.酶液提取： 藻液接种后每隔 1d，取 40ml 藻液（取时需摇匀），于 4℃，于 8 500 r/min （10 000g）下离心 10min 收集藻体， 用 0.1mol/L 、pH7.8 磷酸钠缓冲液 3mL重悬浮， 然后用冰浴超声破碎细胞， 破碎液在 4 ℃下 10200 r/min 离心 10min, 上清液即为 SOD和 CAT粗酶液。 2. 酶活性测定 取 10ml 试管 3支，其中 2支为样品测定管， 1支为空白管，按表 2-14-1 顺序加入试剂。 表2-14-1 紫外吸收法测定 H2O2样品液配置表 管 号 S1 S2 S3 管号 S0 S1 S2 蒸馏水 粗酶液 (ml) 0.2 0.2 0.2 1.0 1.0 1.0 /ml pH7.8磷酸 (ml) 1.5 1.5 1.5 将 S0号管在沸水浴煮 1min 以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在 25℃预热后 ,逐管加入 0.3ml 2 2 0.1mol/L 的 H O ，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中， 240nm 下测定吸光度， 每隔 1min 读数 1次，共测 4min ，待 3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算： 以每分钟 A 240减少 0.1的酶量为 1个酶活单位（ U）。 A240 VT 过氧化氢酶活性 U/(g.min)= 0.1 VS t W ’. ； (AS1 AS 2 ) A 240= A S0 － 2 式中 A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值； A S1, AS2—样品管吸光值； Vt —粗酶提取液总体积（ ml ）； V 1—测定用粗酶液体积（ ml ）； FW—样品鲜重（ g ）； 0.1—A 240每下降 0.1为 1