第六章植物原生质体融合技术.pptVIP

植物原生质体融合基本过程 ◆ 盐类融合法 ◆ 高Ca2+和高pH值融合 ◆ 聚乙二醇（PEG）融合法 ◆ PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 ◆ 电融合法 A. 盐类融合法 盐类融合剂种类 硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2 氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2 葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 盐类融合的优缺点 优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小 缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合 B. 高Ca2+和高pH值融合 Ca2+浓度 0.05 mol/L 具体做法(以烟草为例) 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合; 加入2.2H2O和甘露醇; 再用甘氨酸钠缓冲pH值到，成为融合液，同时在37℃下保温0.5h; 用甘露醇洗净高CaCl2和高pH值； 两种原生质体的融合率达到10%。 C. 聚乙二醇（PEG）融合法 Polyethylene glycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相对分子量200-20000之间 融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合 用相对分子质量为1540的PEG处理40-50 min；再用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核体 D. PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥） 然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG；（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合） 再用培养液洗去高Ca2+和高pH值 PEG诱导原生质体融合过程 E. 电融合法 原理： 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 优点： 对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。 电融合基本过程 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中 微电极型：用5-12微安的脉冲电流间断刺激1-5毫秒，原生质体在几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体,整个过程约10-30分 平行多电极融合装置法：经过1兆赫如150V/cm交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度的直流电脉冲(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体 第六章植物原生质体融合技术 线粒体 质 膜 液 泡 细胞核 内质网 细胞壁 植物细胞模式图 细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%5% ◆ What 基本原理 ◆ 去除植物细胞壁以获得大量的原生质体 ◆ 诱导原生质体融合形成杂种细胞 ◆ 筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化 ◆ 从细胞团，愈伤组织到最后成株 植物原生质体融合基本过程 ◆ Why 技术应用 植物原生质体融合的意义： ◆克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍 ◆为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件 ◆ How 植物原生质体融合技术方法 植物原生质体的制备 植物原生质体的培养 植物原生质体的融合 1、原生质体的概念及培养的意义 2、原生质体材料来源 3、原生质体的分离 4、原生质体的纯化 概念： 除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体 ★ 植物叶片 －取材容易 －比较容易用酶解法分离 ★ 植物根尖组织 －可由各种植物的种子萌发后取得 ★ 植物花粉 －产生单倍体原生质体 ★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞 －细胞壁容易解离 例: 烟草叶肉细胞原生质体的分离 1). 材料的准备与消毒： 2). 酶解： 3). 纯化： 4). 原生质体的活力测定 1). 材料的准备与消毒 选取在温室中生长两个月左右的烟草植株 从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片 经自来水冲洗干净后 放入70%乙醇中进行表面消毒 然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟 接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂 2). 酶解 用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮，将叶片切成2cm长的小片，然后放入含酶溶液中处理。 （注意：使撕去表皮的一面朝下，温度25～28℃ 下经3-4小时的酶解反应，其间轻轻摇动培养皿若干次） 3). 纯化 将酶解悬浮液通过300-400目网，以除去大的未消化的碎片