微生物学《DNA复制和修复》.ppt

微生物学《DNA复制和修复》;第一节 DNA的复制 (DNA replication); ; ; DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制后，DNA的结构仍然可以保持完整，这与它的遗传功能是相符的。 ; Replication of a circular chromosome produces a structure resembling the Greek letter theta (θ), and shows that both strands are replicated at the same time .; Addition of [3H] thymidine for a short period just before the reaction is stopped allows a distinction to be made between unidirectional and bidirectional replication.; ; 3. DNA复制的方向为5 ’ →3’ ，是半不连续的 子链DNA的复制方向都是5 ’ →3’ ，所以母链的读链方向是3 ’ →5’。;一、DNA的聚合反应 从大肠杆菌中提取的DNA聚合酶Ⅰ，能在具备 底物：4种dNTP 模板：一条单链DNA 引物：一小段与模板配对的DNA或RNA， 具备3′-OH Mg2+ 的条件下，使4种 dNTP聚合起来。新加上的dNTP与引物的3 ′ -OH作用，形成3′, 5′-磷酸二酯键，且所加上的核苷酸要与模板上的碱基互补配对，合成方向是从5′→3′。; ; 二、与DNA聚合有关的酶 ⒈ DNA聚合酶 ⑴ 原核生物DNA聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ (Pol Ⅰ)由大肠杆菌的polA基因编码的一条多肽链，分子量为109KD，每个大肠杆菌中约有400个Pol Ⅰ分子，它催化脱氧核苷酸聚合的速度为1000个/分。 Pol Ⅰ具有的功能： ⑴ 按5′→3′方向延长核苷酸链的功能； ⑵ 3′→5′外切酶的功能； ⑶ 5′→3′外切酶的功能； 该外切酶功能的特点是切去的核苷酸是正确配对的，这种功能在DNA的复制中引物的切除及DNA损伤的修复中起着重要作用。 ;正常的碱基互补配对;DNA; DNA的5′→3′外切酶功能可以切除一段与模板配对的DNA或RNA链，同时又可以合成一段新的DNA单链，表现为“切口位移”。; 用枯草杆菌蛋白酶将Pol Ⅰ水解成大、小两个片段，大片段有聚合酶和3′→5′外切酶的功能，又称为Klenow片段。; DNA聚合酶Ⅱ( PolⅡ)也需要模板、引物、底物和Mg2+，合成方向也是5′→3′,也具有3′→5′外切酶功能，但没有5′→3′外切酶功能。它只在无PolⅠ和PolⅢ的 时候才发挥聚合酶作用,每个大肠杆菌中有约40个酶分子。 DNA聚合酶Ⅲ (PolⅢ)在大肠杆菌中的量只有PolⅠ的1/20，但活性比PolⅠ高40倍以上，每分钟能催化105个核苷酸的聚合，是大肠杆菌中真正负责合成DNA的聚合酶，由多种亚基组成。; ;E.coliDNA聚合酶Ⅲ的亚基组成及主要功能;E.coli DNA聚合酶Ⅲβ-亚基形成环状结构围绕着DNA双链。; ; 复制的保真性 DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对，使遗传信息延续、传代的保证。要确保DNA复制的保真性，至少依赖三种机理： ⒈ 遵守严格的碱基配对规律； ⒉ 聚合酶在复制延长中对碱基的选择作用； ⒊ 复制中出错时有及时的校对功能。 ; ⒉ DNA连接酶(ligase)