决明Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因(CoTI2)的克隆、表达与分析-生物化学与分子生物学专业毕业论文.pdfVIP

西南交通大学硕士学位论文主要工作(贡献)声明 本人在学位论文中所做的主要工作或贡献如下： 1)基于决明转录组数据中编号为BMK．39169的序列，首次克隆了决明Kunitz型 胰蛋白酶抑制剂基NI(CoTl2)的全长cDNA序列，该序列长度为792bp，包含一个长度 为746bp的ORF，编码一条长度为248个氨基酸的肽链。通过生物信息学初步对CoTl2 蛋白的亚细胞定位、亲疏水性、与其他物种的进化关系以及密码子偏好性做了分析。 同时，对CoTl2蛋白的跨膜结构域、二级结构、信号肽以及基本理化性质进行预测， 这为后续研究CoTl2的分子机理与功能奠定理论基础。 2)根据决明CoTl2全长cDNA序列，设计实时荧光定量PCR的特异引物，分析 了CoTl2在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式，为后期研究决明在低温、干旱、 高盐、ABA以及Meja等胁迫下的代谢通路提供依据。 3)首次构建 了CoTl2 ．pET28a 原核表达重组质粒 ，转入大肠杆菌Rosetta(DE3) 中 诱导表达，检测重组蛋白的可溶性，并获得最佳表达条件，这为CoTl2蛋白的分离纯 化及生化功能鉴定奠定基础。 4)构建了ZCoTl2。pBll21真核表达重组质粒，并转化拟南芥，初步得到了含重组 蛋白的拟南芥，这为研究CoTl2在植物中的生理作用以及后代遗传打下基础。 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成 果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体己经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中作了明确说明。 本人完全了解违反上述声明所引起的一切法律责任将由本人承担。 。。 兰竺敝赁，獬：捣妈 日期：∥心．s t ／(} 万方数据 西南交通大学硕士研究生学位论文 第1页 摘要 决明(Cassia obtusifolia L．)是豆科一年生植物，作为传统药食同源的中草药，其干 燥成熟种子即为决明子，是主要的药用部位。前期研究表明，决明中含有胰蛋白酶抑 制剂，具有抗鳞翅目害虫的活性。本文首先通过对决明转录组数据的分析，从中筛选 出一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的候选基因，随后对该候选基因展开基因克隆、表达、 生物信息学和表达模式分析，为后期该基因的功能鉴定与分子机制的研究提供依据。 主要结果如下： 1)采用RACE技术，首次克隆了决明Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基N(CoTl2)全长， 该序列全长为792bp，包含746bp的ORF，编码248个氨基酸，所表达的蛋白分子量 为26．68 KDa，等电点为5．03，其中含有11．26％的酸性氨基酸，7．1％的碱性氨基酸， 36．94％的中性疏水氨基酸和27．48％的中性亲水氨基酸，具有较强的疏水性。 2)通过生物信息学初步对CoTl2蛋白的基本理化性质与结构进行预测：CoTl2的 N端含有26个氨基酸的信号肽；主要定位于植物的膜外或液泡中，并且N端1．11个 氨基酸残基在膜内，35．247个氨基酸残基在膜外，为跨膜蛋白；通过酶切位点分析， 确定了CoTl2原核表达酶切位点分别为BamHI和EcoRI，真核表达酶切位点为BamHI 和SnaBI；密码子偏好性分析表明决明CoTl2主要偏好使用以U ／A结尾的密码子，这 有利于CoTl2选择最优表达系统；CoTl2的二级结构中包含66个氨基酸的0t螺旋，28 个D折叠和154个无规则卷曲，无规则卷曲结构占总氨基酸的一半以上，推测决明CoTl2 的功能结构域很可能就在这个位置；同源性分析出Lysl08为关键残基，还含有Cys84， Cysl35，Cysl87，Cys200四个Cys，可能参与二硫键的形成；通过对CoTl2与其他物 种KTI的进化关系分析得出，CoTl2与拟南芥进化关系更近，是最优真核表达系统。 3)RT．qPCR结果表明决明CoTl2在不同组织中差异表达，在未成熟种子、果荚、 愈伤组织和胚轴中优势