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植物组织培养灭菌技术
对培养基和器皿的彻底灭菌及正确的无菌操作是防止染菌、 保证
组培材料正常生长及分化的关键, 是植物组织培养工作中最基本, 也
是最重要的技术。
一、植物组织培养灭菌
1.湿热灭菌(培养基) :在制备后的 24h 内完成灭菌工序。
⑴对高压灭菌后不变质的物品,可以延长灭菌时间或提高压力。
⑵对于一些布制品,洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭菌
20-30min 。
⑶高压灭菌前后的培养基,其 pH值下降 0.2-0.3 单位,要控制好灭
菌的温度和时间
⑷高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖, 从而改变培养基的
渗透压。
⑸培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解, 高压下蔗糖水解大大
增强,添加 1%活性炭,蔗糖水解率可达 5%。
注意事项:防止高压灭菌培养基变化的方法
) 经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,及时采取有效
措施。
(2) 设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。
如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以 IBA 代替 IAA,控制活性炭
的用量 ( 在 0.1%以下) 注意 pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
(3) 配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙
和铁放在最后加入。
(4) 注意高压灭菌后培养基 pH值的变化及回复动态。 如高压灭菌后的
pH值常由 5.80 升高至 6.48 。而 96h 后又回降至 5.8 左右。这样在实
验中就可以根据这一规律加以掌握。
2. 过滤灭菌(不耐热的物质)如一些抗生素类物
3. 紫外线和熏蒸灭菌(空间)
(1) 紫外线灭菌:在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫
外线的波长为 200—300nm,其中以 260nm 的杀菌能力最强,但是由
于紫外线的穿透物质的能力很弱, 所以只适于空气和物体表面的灭菌,
而且要求距照射物以不超过 1.2m 为宜。在接种前打开紫外灯进行房
间及超净台灭菌 30min,然后进行接种。
(2) 熏蒸灭菌:用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态
扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只
需要把消毒的空间关闭紧密即可。
常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按 5—8ml /m3用量,
将甲醛置于广口容器中,加 5g/m3 高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间
可预先喷湿以加强效果。 冰醋酸也可进行加热熏蒸, 但效果不如甲醛。
4. 喷雾灭菌(物体表面)
物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物
材料表面等,可用 70%的酒精反复涂擦灭菌, l%-2%的来苏儿溶液以
及 0.25%— 1%的新洁尔灭也可以。
5. 植物材料表面用消毒剂灭菌(外植体)
从外界或室内选取的植物材料, 都不同程度地带有各种微生物。 这些
污染源一旦带人培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须
经严格的表面灭菌处理, 再经无菌操作手续接到培养基上, 这一过程
叫做接种。
第一步,将采来的植物材料除去不用的部分, 将需要的部分仔细洗干
净,置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时, 冲洗时间视材料清洁
程度而宜。 17:02:37
洗时可加入洗衣粉清洗, 然后
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