植物组织培养灭菌技术.pdf

植物组织培养灭菌技术 对培养基和器皿的彻底灭菌及正确的无菌操作是防止染菌、 保证 组培材料正常生长及分化的关键， 是植物组织培养工作中最基本， 也 是最重要的技术。 一、植物组织培养灭菌 1．湿热灭菌（培养基） ：在制备后的 24h 内完成灭菌工序。 ⑴对高压灭菌后不变质的物品，可以延长灭菌时间或提高压力。 ⑵对于一些布制品，洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌 20-30min 。 ⑶高压灭菌前后的培养基，其 pH值下降 0.2-0.3 单位，要控制好灭 菌的温度和时间 ⑷高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖， 从而改变培养基的 渗透压。 ⑸培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解， 高压下蔗糖水解大大 增强，添加 1%活性炭，蔗糖水解率可达 5%。 注意事项：防止高压灭菌培养基变化的方法 ) 经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，及时采取有效 措施。 (2) 设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。 如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以 IBA 代替 IAA，控制活性炭 的用量 ( 在 0.1%以下) 注意 pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。 (3) 配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙 和铁放在最后加入。 (4) 注意高压灭菌后培养基 pH值的变化及回复动态。 如高压灭菌后的 pH值常由 5.80 升高至 6.48 。而 96h 后又回降至 5.8 左右。这样在实 验中就可以根据这一规律加以掌握。 2. 过滤灭菌（不耐热的物质）如一些抗生素类物 3. 紫外线和熏蒸灭菌（空间） (1) 紫外线灭菌：在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫 外线的波长为 200—300nm，其中以 260nm 的杀菌能力最强，但是由 于紫外线的穿透物质的能力很弱， 所以只适于空气和物体表面的灭菌， 而且要求距照射物以不超过 1.2m 为宜。在接种前打开紫外灯进行房 间及超净台灭菌 30min，然后进行接种。 (2) 熏蒸灭菌：用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态 扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只 需要把消毒的空间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按 5—8ml ／m3用量， 将甲醛置于广口容器中，加 5g/m3 高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间 可预先喷湿以加强效果。 冰醋酸也可进行加热熏蒸， 但效果不如甲醛。 4. 喷雾灭菌（物体表面） 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物 材料表面等，可用 70%的酒精反复涂擦灭菌， l%-2%的来苏儿溶液以 及 0.25%— 1%的新洁尔灭也可以。 5. 植物材料表面用消毒剂灭菌（外植体） 从外界或室内选取的植物材料， 都不同程度地带有各种微生物。 这些 污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须 经严格的表面灭菌处理， 再经无菌操作手续接到培养基上， 这一过程 叫做接种。 第一步，将采来的植物材料除去不用的部分， 将需要的部分仔细洗干 净，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时， 冲洗时间视材料清洁 程度而宜。 17:02:37 洗时可加入洗衣粉清洗， 然后