具有较好血清稳定性的环状siRNA的构建及其在RNA干扰中的应用研究.pdfVIP

摘要 。—————————————————————————————————————————————一 摘要 RNA干扰是由双链RNA介导的序列专一性的转录后基因沉默现象。 从这一 现象在秀丽隐杆线虫中被发现以来，对其机理的研究及其在医疗中的应用成为 生物、化学、医学、药学等领域最为热门的研究课题之一。不同于传统的化学 小分子和蛋白药物存在的专一性差、许多靶标无法针对等缺点，基于RNA干扰 的药物疗法几乎可以专一并高效地治疗所有疾病。大量的动物和人类实验证明 RNA干扰是一种具有巨大潜在价值的治疗方法。但是，小干扰RNA的临床应用还 需要克服血清中稳定性差、脱靶效应、机体免疫反应和不易有效给药等困难。 研究人员希望通过对小干扰RNA的磷酸骨架、糖环和碱基的化学修饰来提 高其血清稳定性或增强其链选择性来降低脱靶效应。但是一些针对核苷酸的化 学修饰会造成细胞毒性或者影响其基因沉默效率。因此，设计无需引入非天然 核苷酸而有效的具有较好血清稳定性的小干扰RNA应用于RNA干扰技术是非常 值得研究的课题。通过对双链RNA的结构修饰可以帮助解决小干扰RNA应用中 所面临的难题并且避免核苷酸修饰造成的副作用。 基于这一思想，本文首次使用连接小分子1，2一双(马来酰亚胺)乙烷和不 同序列的末端巯基修饰寡核苷酸通过迈克尔加成反应成功得到了单链的环状 RNA分子，并通过非变性丙烯酰胺凝胶电泳分析、纯化以及超高效液相色谱和质 谱鉴定。然后将正、反义链的环状RNA分别与其相互补的寡核苷酸退火得到三 种新型的环状小干扰RNA分子。本文研究了环状小干扰RNA的物理和生化性质 及其RNA干扰活性。研究发现虽然环状修饰阻碍了双链完全互补配对使得环状 小干扰RNA的热力学稳定性相比于天然的小干扰RNA有不同程度的降低，但这 一修饰并没有影响其A型双螺旋结构。相比于天然的小干扰RNA，环状小干扰 RNA在正常人血清中展现出了较好的稳定性。通过体外人重组Dicer酶切割研究 发现环状小干扰RNA同天然长双链RNA一样能被Dicer识别切割。最后，通过 双荧光素酶检测系统检测其RNA干扰活性证明环状小干扰RNA在人胚肾293A细 胞中能够发挥较好的基因沉默效果，特别是反义链环状小干扰RNA具有与经典 的小干扰RNA相当甚至更好的活性。 关键词：RNA干扰，小干扰RNA，化学交联，环状修饰，血清稳定性 Abstract RNA a post—transcriptionalgene silencing interference(RNAi)is sequence—specific phenomenon which is mediated by double—stranded RNA(dsRNA)．Since it was first discovered in Caenorhabditis elegans，RNAi quickly became an important research area both in its mechanism study and therapeutic application，especially after the short interfering RNA(siRNA)was demonstrated to be quite effective in mammalian cells．However,the application of synthetic siRNA in vivo faced some obstacles，like low stability in biological fluids，off-target effects and effective means of delivery． Scientists have introduced numerous chemical modifications to the phosphate backbone；ribose and bases to stabilize siRNAs against the nucleases in the serum or increas