蛋白质样品的制备精品课件.pptVIP

第二章 蛋白质样品的制备;;第一节 样品制备总则;;二、样品制备的原则;三、流程;第二节 样品破碎与分离蛋白质;;（一）温和的裂解方法 通常应用于组分比较简单的样品，例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。;1. 渗透裂解 非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶 胀而释放出细胞内容物。 ;2. 冻融裂解 许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要 求为止。 ;3. 裂解液裂解 含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行 悬浮处理。;4.酶裂解 有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。 ;;1. 超声裂解法 超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫， 样品处理应在冰浴中进行。;;3.研磨法 用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研 磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。;;;;⑴ PMSF(苯甲基磺酰氟） 是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。 ⑵ AEBSF 为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L，作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。但 是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。;⑶ 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA） 乙二醇双四乙酸（EGTA） 通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。 ⑷ 肽蛋白酶抑制剂 亮抑酶肽（leupetin），它是可逆??蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。;;四、分离和提取蛋白质（蛋白质沉淀步骤） 这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结 果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的 样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后 并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉 淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。;;⑵ TCA沉淀（三氯醋酸沉淀） 这是一种有效的蛋白沉淀方法，将TCA加到提取液中，终浓度将高达10％-20 ％。蛋白质可于 冰上沉淀30min。另外，组织样品可以直接用10 ％-20 ％的TCA进行匀浆。这种方法可限制蛋白降 解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉 淀，以除去TCA。 然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完全再溶。残留的TCA必须通过乙醇或丙酮彻底清除，若过多暴露与低PH溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。;;;⑸ 用苯酚提??，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀 这对于杂质含量高的植物样品很有效。 蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时较多。; 在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是指对样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其目的是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用；使蛋白质变性及还原；去除非蛋白质组分，如核酸、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质