植物组织总DNA的提取与浓度测定.pptx

实验十一 植物组织总DNA的提取及DNA的浓度测定 ;二、实验原理 ; 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。; DNA的吸收光谱峰在260 nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50 μg/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。 由于蛋白质的吸收峰在280 nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。;水稻品种的幼苗叶片;四、实验器具、药品试剂; CTAB法流程图;五、实验方法;（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； （8） 用移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；;（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 μl的75%乙醇及80 μl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中； （11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12） 10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 μl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；;（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）； （14）加入50 μl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解； （15）置于-20℃保存、备用。;称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃ ) CTAB及β-巯基乙醇 ; 取提取的DNA溶液2 μl(约100-200 ng)至一干净的离心管，加入198 μl蒸馏水稀释。先200 μl蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，然后倒掉蒸馏水，加入200 μl已稀释的DNA溶液，测定260 nm及280 nm的光吸收值（OD260及OD280），计算DNA浓度及OD260/OD280比值。计算公式如下: dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数 以上浓度单位为?g /ml;（1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。