EMSA实验步骤 (2)文档.docVIP

EMAS 1. 配置6%的SDS蛋白胶，凝结30min。 2．预电泳：100v，30-60min，在预电泳过程中配置如下表结合反应，加入探针之前先混匀反应液，室温静置10min，加入探针后再静置20min。 Component Final Amount Control Reactions #1 #2 #3 Ultrapure Water 12μL 11μL 9μL 10X Binding Buffer 1X 2μL 2μL 2μL 50% Glycerol 2.5% 1μL 1μL 1μL 100mM MgCl2 5mM 1μL 1μL 1μL 1μg/μL Poly (dI?dC) 50 ng/μL 1μL 1μL 1μL 1% NP-40 0.05% 1μL 1μL 1μL Protein extract 2μL 2μL Biotin probe 2μL 2μL Total Volume 20μL 20μL 20μL 3. 加入5μl 5×Loding Buffer，轻柔上下吹匀，不可剧烈混匀 4. 电泳：100V电泳30-40min，溴酚蓝迁移至胶底部2/3或3/4处停止电泳 5. 将尼龙膜剪成与蛋白胶大小相同或稍小，剪角做标记，浸于0.5×TBE，至少10min。 6. 用冷却至4°C的0.5×TBE和干净的海绵，镊子，手套进行转膜 7. 100V，380mA 4°C转膜30-60min， 8. 转膜结束后，将膜（带有溴酚蓝的一面）放在干纸巾上1min，使膜表面的缓冲液吸进膜内, 不能使膜变干。立即进行80°C 高温交联2h 9. 用15ml 加热至42°C的封闭液Blocking Buffer封闭膜，轻柔摇床孵育15min 10. 将50μl Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate加至16ml Blocking Buffer中，配制Conjugate/ Blocking Buffer。 11. 倒掉封闭液，加入上步的Conjugate/ Blocking Buffer，轻柔摇床孵育15min 12. 将40ml 4×Wash Buffer加至120ml纯水中，配制1×Wash Buffer 13. 将膜移入新平皿内，用20ml 1×Wash Buffer短暂漂洗1min 14. 用20ml 1×Wash Buffer轻柔摇床洗膜3次，每次5min 15. 将膜移入新平皿内，加入30ml 平衡液Substrate Equilibration Buffer，漂洗5min 16. 避光将6ml Luminol/Enhancer Solution加至 6ml Stable Peroxide Solution中，配制成Substrate Working Buffer 17. 将膜取出，用纸巾轻轻接触膜的边缘，吸掉残余的Buffer，移入新平皿内 18. 用Substrate Working Buffer覆盖膜的全部表面，不要摇动，孵育5min 19. 将膜从Substrate Working Buffer提起，用纸巾轻轻接触膜的边缘，吸掉残余的Buffer，但不要使膜变干。 20. 用保鲜膜包住尼龙膜，避免气泡和起皱。 21. 显影并拍照