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分子生物学实验方法分子生物学会计学第1页/共83页 举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。 第2页/共83页生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。研究蛋白质相互作用的方法也就具有更为重要的意义。第3页/共83页第4页/共83页蛋白质相互作用研究方法生物物理学方法分子生物学方法遗传学方法噬菌体展示技术酵母双杂交技术蛋白质亲和色谱法 免疫共沉淀基因外抑制子细菌双杂交技术荧光共振能量转移技术合成致死筛选第5页/共83页蛋白质亲和色谱protein affinity chromatography ?基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose离子交换琼脂糖），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。第6页/共83页结合（3）固定诱饵蛋白（1）洗脱（2）洗脱（4）收集（5）检测（6）第7页/共83页融合蛋白pull-down实验 为了更有效地利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ,GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。第8页/共83页 GST融合蛋白在经过固定有GSH(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用第9页/共83页 以上两种方法都有共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能是由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可能是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。实验结果还应经其他方法验证。 第10页/共83页免疫共沉淀 coimmunoprecipitation, CoIP 以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。该法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免人为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白，另外灵敏度不如亲和色谱高。第11页/共83页第12页/共83页荧光共振能量转移技术 fluorescence resonance energy tran sfer , FRET 在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一个基团（受体）的吸收光谱有一定重叠，当这两个荧光发色基团在足够近（100埃）时，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。第13页/共83页第14页/共83页BFPGFPCFPYFP 激发波长 发射波长 B: blue 383 448 G: green 488 510 C: cyan 434 477 Y: yellow 513 532第15页/共83页 荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辨率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。?? 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。受荧光发色基团空间距离的限制,只能研究分子量小于200 kD的蛋白，而且检测的设备昂贵。第16页/共83页噬菌体表面展示 噬菌体表面展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。 其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目