蛋白样本制备定量及western步骤详解.pptxVIP

蛋白样本制备定量及western步骤详解会计学ELISAprotein microarraysSDS/IEFactivity assays2-DEEMSA一 蛋白样本制备成功蛋白分析的基础蛋白样本制备的目的: 后续应用蛋白样本immunoblottingmass spectrometry二 蛋白样本制备的原则方法应具备标准化，具有重现性 、可靠性、简便性；蛋白样本制备原则尽量抽提完全；应使所有蛋白全部处于溶解状态防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性防止在抽提过程中发生化学修饰如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。二 蛋白样本制备的策略制备蛋白的目的活性分析 免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀1D 2D EMSA CHIP等实验材料 细胞 组织 固定组织或石蜡包埋组织 微生物 酵母 植物 提取RNA后的剩余的蛋白样本等目的蛋白的结性质与分布分布于胞桨/胞核/膜 可溶/不可溶 含量多少 分子量大小 四级结构特征 磷酸化等修饰……方法的选择 1 自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取 2 购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取离心收集裂解样品定量检测细胞加入裂解液冰上放置10-15分钟高速离心收集上清即得全蛋白样本蛋白定量和SDS检测三 案例分析-- 细胞中总蛋白的制备缓冲液表面活性剂蛋白酶抑制剂其它：H2O、NaCl、等RIPA