天根质粒小提试剂盒说明书(DP103) .docVIP

第 PAGE 页码 页码页 / 总页数 NUMPAGES 总页数 总页数 页 天根质粒小提试剂盒说明书(DP103) 天根质粒小提试剂盒说明书（DP103） 注意事项 1. 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项 2. 溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8°C保存。 3. 使用前请先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37°C水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。 4. 注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。 5. 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000rpm(~13，400g)。 6. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。 7. 实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。 8. 用平衡液BL处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。 9. 去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列）等核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。 操作步骤 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 1. 柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μI的平衡液BL，12,000rpm(~13,400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） 2. 取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(~13,400g)离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μI溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀注意如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 4. 向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由千菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 5. 向离心管中加入350μI溶液P3.立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(-13,400g)离心10min。 注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(~13,400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 7. 可选步骤向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(-13,400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。 如果宿主菌是endA+宿主菌(TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。 如果宿主菌是endA-宿主菌(DH5α，TOP10等），这步可省略。 8. 向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(~13,400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 9. 重复操作步骤8。 10. 将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm(~13,400g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 11. 将吸附柱CP3置于个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(~13,400g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20°C，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(~13,400g)离心2min，将质粒溶液收集到离心管中