蛋白质结构分析.pptxVIP

会计学;第一节 蛋白质样品的准备;二、HPLC纯化的样品 如果样品是用反相HPLC纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，它们在 真空离心干燥或冻干样品时除去；如果蛋白质是用离子交换HPLC或疏水 HPLC或凝胶过滤HPLC精制的，则样品要进行脱盐。 脱盐或稀蛋白溶液的浓缩可用0.1％三氟乙酸(TFA)—乙腈(ACN)系统 的短柱反相HPLC；也可采用一次性的Sek-Pak，因为蛋白质是水溶性 的，所以先用能与水互溶的甲醇或乙腈(2ml)润之，再用5ml纯水洗 涤；然后样品液体通过Sep-Pak柱时，蛋白质保留在柱上，小分子的盐 类流过柱体，用水溶液充分洗涤后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白质。 小的超滤装置对浓缩蛋白质也是有效的。此外，有机溶剂或TCA沉淀 也可以考虑。 三、蛋白质样品中的二硫键和巯基(一SH) 当蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也除得比较“干净”，在进行 酶解前，还要转变半胱氨酸残基成其他的稳定的衍生物。因为半胱氨酸 的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键， 因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。 常用有碘代乙酸烷化，因为这个反应是快速和专一的；同时这类试剂 保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂的矫作物(artifact)容易得到放 射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了其在水溶液中的 溶解度。