南开大学基因操作原理课件第三章[1].pptVIP

第三章 用于基因操作的工具酶;1.用于基因操作的工具酶总览 2.限制性核酸内切酶 1)寄主控制的限制与修饰; 2)限制酶与修饰酶; 3)限制酶的类型; 4)限制酶的命名; 5)限制酶的靶序列; 6)同裂酶. ;3.连接酶 1)DNA连接酶的作用机制; 2)DNA连接酶的性质与应用. 4.末端修饰 1)Double-linker; 2)Adaptors; 3)Homopolyer tailing.; 1. Useful Enzymes for Molecular Cloning;;; 2. Restriction Endonucleases;;(1);Plating Efficiencies of Phage Grown on Strains C,K and B When Plated on These Bacteria Strain Phage C K B lambda-C 1 10-4 10-4 lambda-K 1 1 10-4 lambda-B 1 10-4 1 ;;;;(2);;;Note: ①.限制性核酸内切酶共分三型,用于基因操作的 是II型(目前从II型酶中分出一些酶,划归为IV型酶); ②.编码寄主控制的R-M系统的基因,有的存在于 染色体上,有的存在于质粒或原噬菌体上; ③.最早分离的限制酶是从K中分离的 (1968.Moselson,Yuan);;Notes ①.产生平末端; ②.粘末端,5‘突出; ③.粘末端,3‘突出; ④.II型酶,它不在识别序列内切割,而在右侧切割,N指任意核苷酸（这些酶与II型酶尚有差别，分出来划归IV型酶）; ⑤.Pu指A or G,Py指C or T,凡符合条件的碱基配对均可切割; ⑥.在一些条件下(低离子强度,碱性pH,50%以上的甘油浓度),EcoRI的特异性降低,只要符合中间四个碱基即可, 称EcoRI星活性(EcoRI*)。许多其他的酶也有这种性质。 ⑦. EcoRI II未按规则,I II指两个酶分别位于两个抗性转移因子(质粒) RI RII上;4)Nomenclature(Smith Nathans) (1).三字母组成(斜体) Escherichia coli Eco(埃希氏菌属,大肠杆菌) Haemophilus influenzae Hin(嗜血流感杆菌属,嗜血流感杆菌) (2).代表株或型的字母 EcoK K 菌株(EcoR限制修饰系统位于质粒RY13上) (3).同一宿主同时有几个不同的R-M系统,用罗马数字表示 HindI II III嗜血流感杆菌Rd菌株的三个R-M系统. (4).同时提到限制酶与修饰酶时,加R,M区分RHindIII(限制酶) M HindIII(甲基化酶) 【EcoRI II未按规则,I II指两个酶分别位于两个抗性转移因子(质粒)上】;5) .Target Site(靶序列） （1）结构:II型限制酶靶序列均为回文结构，???以是4，5，6，7个核苷酸； EcoRI 5‘-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ （2）末端： 粘末端--靶序列被限制酶切割后形成具有突出的5‘或3’端 Cohesive end EcoRI 5’-G-3’ 5’-AATTC-3’ 3’-CTTAA-5’ 3’-G-5’ Blunt end--HaeIII 5’-GG CC-3’ 3’-CC GG-5’ （3）数目： 假定靶序列随机地分布在DNA序列中 4核苷酸 44=256bp;6核苷酸46=4096bp;（4）relaxed target site(松弛型靶序列） （星活性，star activity；第二活性 the Second activity) 限制酶的识别序列被特异性放宽，导致附加切割。 如：EcoRI* G AATT C________