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测序常见问题及解决策略 一、 PCR 常见问题 1. 假阴性，不出现扩增条带 PCR 出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因： 1） 模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板 时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。 2） 酶：酶失活或反应时忘了加酶。 3） Mg2+浓度:Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 4） 反应条件：变性对 PCR 扩增来说相当重要， 如变性温度低， 变性时间短， 极有可能出现假阴性 ;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩 增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR扩增效率。 5） 靶序列变异： 靶序列发生突变或缺失， 影响引物与模板特异性结合， 或因 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列， 其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致， 有时其条带更整 齐，亮度更高。常见原因有： 1） 引物设计不合适： 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性， 因而在进 行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引 物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 2） 靶序列或扩增产物的交叉污染： 这种污染有两种原因： 一是整个基因组或 大片段的交叉污染， 导致假阳性。 这种假阳性可用以下方法解决