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bvdv感染个体牛血清样品检测 摘要：为筛选和建立准确、快速、敏感的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）检测方法，根据BVDV基因序列高度保守的5’UTR区，合成1对特异引物，从疑似BVDV感染的个体牛血清中提取RNA作为模板，采用二重PCR方法，获得252 bp特异性扩增产物，以此鉴别是否感染BVDV。结果表明，用该方法对同一牛场混合血清样品进行检测，发现该牛场存在BVDV感染。实验证明，该方法检测牛群是否感染BVDV，简单、快速、灵敏，且经济、方便、实用，在牛群BVDV检疫中具有较好的实用价值。 牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）不仅是引起犊牛腹泻、妊娠牛流产的一种常见传染病病原，还是存在于犊牛血清，导致细胞及其相关生物制品生物污染的主要病原之一目前，国内外报道用于检测和诊断BVDV的主要方法有血清学、免疫学和分子生物学诊断方法等1 材料与方法1.1 实验毒株BVDV标准株为美国Orengen C24毒株。本研究于2019年5月随机采集周边一牛场成年牛和犊牛全血各20份。血样冷藏，在采集后24 h内分离血清冻存。临床样品分别采自新疆伊犁一规模化牛场春季爆发腹泻的犊牛全血6头份，样品均-20℃冻存备用。1.2 试剂盒与工具酶1.3 实验设计1.3.1 BVDV ELISA检测按照试剂盒说明书进行操作。1.3.3 病毒RNA的提取按照QIAGEN Viral RNA Minixtraction Kit的操作说明进行提取。提取的RNA用30μL去RNA酶水溶解，立即做RT-PCR检测或冻存备用。1.3.4 二重PCR扩增取扩增产物2μL作模板，按上述程序再做二轮PCR扩增。获得扩增产物按照上述步骤进行保存记录。2 结果与分析2.1 健康成年牛混合血清和犊牛混合血清的二重PCR检测结果RT-PCR扩增结果除BVDV标准株显示有阳性目的带，其他均为阴性。用其扩增产物做二轮PCR后，均获得目的产物（图1）。2.2 血样中BVDV病原的ELISA检测伊犁牛场的腹泻犊牛的6份血液样品中检出阳性一份（图2）。2.3 疑似牛BVDV感染的腹泻犊牛样品BVDV的二重PCR检测结果用RT-PCR扩增BVDV标准毒株得到252 bp目的带（图2）；二重PCR扩增后腹泻犊牛的6份样品产物，6个样品出现目的片段（图3）。3 讨论(1)RT-PCR用于BVDV的检测在国内外都有报道。国内魏栋等(2）国内无检测BVDV的商品购买，进口酶免试剂盒价格昂贵，不适用于基层，而病毒分离技术要求高，步骤烦琐复杂，而且耗时。本研究直接采集牛血液样品，分离血清，利用二重PCR方法获得特异性目的产物，同时还对规模化牛场疑似BVDV感染牛进行了群体抽样，采用混合血清检测，仅随机采集20头就能获得可靠的结果，说明敏感性很高。由于BVDV可造成牛的持续性感染和免疫耐受（PI），感染动物可以长期或终身带毒，是BVDV的一个重要的传染源。二重PCR方法检测BVDV将对确定牛场是否感染BVDV，鉴定牛场是否存在PI牛，提供了一个经济实惠、切实可行的检测手段。(3）众所周知，猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株需要在原代牛睾丸细胞中培养增殖，这就必须事先对使用的牛睾丸细胞进行BVDV检测，利用二重PCR对已经确定为原代牛睾丸细胞BVDV感染阳性的细胞进行了检测证实，结果发现与酶免检测结果符合性很好，特异性非常高。可以证明，此方法经济、方便、实用。并且一次可以单个或多个样品检测，与酶联方法的批量检测相比，有着不可比拟的优势，可以推广应用。QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit、d NTPS、Taq DNA聚合酶、DL 2 000 bp Maker等均为TIAN GEN生物科技公司产品。Takara One Step RNA PCR Kit(AMV）购自大连宝生物公司。1.3.2二重PCR实验设计引物设计根据文献报道1.3.4 RT-PCR扩增反应总体系为25μL：在0.5μL的Eppendorf管中依次加人10×Buffer 2.5μL,Mg