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重组人干扰素α-2b生产工艺设计 (赵杨杨，河南城建学院，平顶山，4567000) 摘要：重组人干扰素α-2b(rIFN 2b)是一种广谱抗病毒、抗肿瘤和调节机体免疫功能的药物。干扰素是病毒进入机体后诱导宿主细胞产生的反应物，它从细胞释放后可促使其他细胞抵抗病毒的感染，干扰素增强免疫功能的机理是：调节机体的免疫监视，防御和稳定功能，使杀伤(NK)细胞、Tc细胞的细胞毒杀伤作用增强；使吞噬细胞的活力增强；诱导外周血液中单核细胞活性；增加或诱导细胞表皮主要组织相容复合物抗原的表达。临床用于治疗多发性骨髓病，后天免疫缺损症(AIDS)病人所患的卡波济肉瘤、恶性黑色素瘤、毛状细胞白血病及慢性活动性乙型肝炎。 关键词：重组人干扰素α-2b、菌种构建、分离、纯化、检测 1.基因工程假单胞杆菌菌种的建立 1.1干扰素基因的克隆 从感染新城疫病毒的人血红白细胞中分离干扰素α-2b基因的mRNA，由逆转录酶将Poly（A）RNA反转录形成cRNA第一链。再由DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段催化聚合形成cDNA第二条链。在dCTP存在的条件下，利用末端转移酶给cDNA加Poly（dC)尾，连接到质粒pBR322上。转化到大肠杆菌感受态细胞中，并用氨苄青霉素和四环素筛选抗性克隆，获得编码人干扰素α-2b的基因序列。 1.2干扰素表达载体的构建 把干扰素基因与宿主载体pAYC37连接，筛选出序列正确的表达载体pVG。将表达载体导入假单胞杆菌中，筛选得到干扰素工程菌，表达重组人干扰素-α-2b不低于2.0×109IU/L，并具有氨苄青霉素、四环素和链霉素的抗性。 2. 重组人干扰素α-2b发酵与纯化 2.1重组人干扰素α-2b工程菌的发酵 取菌种1ml接种于100ml LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)的锥型瓶中,摇床30℃震荡培养6~7h,OD值达0.6~0.7h,按1∶20的比例转种于1000ml LB培养基中,摇床30℃震荡培养7~8h,OD值达1.0~1.2h,接种30L发酵罐中,30℃培养4~5h后,42℃培养4h,离心收集菌体。 2.2菌体破碎及包涵体的提取 将菌体加入A液悬浮洗涤3~5次,取洗涤后的菌体加入4倍体积的A液,冰浴条件下超声破碎15次,30s/次,每次间隔30s,离心收集沉淀,加入B液和C液各洗涤3次,离心后收集沉淀物即为包涵体。 2.3包涵体的溶解及复性 包涵体加入5倍体积的D液,冰浴条件下,抽提2h,再将抽提液迅速用E液100倍稀释,4℃放置2h后装透析袋,于20倍体积的F液透析20~24h。 2.4　重组人干扰素α2b的纯化 离子交换柱层析:采用DEAE Sepharose(FF)柱,柱型XK30/50。用F液平衡后,将上述透析后的复性液样品上样,流速为20ml/min,上样结束后,以含不同浓度NaCl的F液洗脱,收集干扰素活性峰。选用Sephacryl00/50XK层析柱,S-100填料,柱体积1700ml,用G液平衡后,将离子交换柱层析收集的干扰素活性峰样品经凝胶过滤,上样量为柱床体积的5%,再收集干扰素活性峰,合并样品进行以下检定。 3. 重组人干扰素α-2b的检定[2] 3.1生物学活性检测　 选用微量细胞病变抑制法(Wish细胞-VSV病毒系统)进行检测。 3.1.1 将ⅦSH细胞(人羊膜传代细胞株)接种于96孔培养板，置37℃5％CO2温箱中培养12—18h使其生长成单层。 3.1.2 去除营养液，依次加入系列稀释的IFN检品，每个稀释度各加2孔。同时设不同稀释度的IFN标准品对照，细胞对照和病毒对照。37℃5％CO2温箱中孵育过夜。 3.1.3 去除IFN溶液，用100TCID5的VSV攻击(细胞对照孔加不含病毒的营养液)，再培养1—2do待病毒对照孔细胞全部或75％以上出现明显病变时，即可在倒置显微镜下观察结果或用结晶紫将细胞染色后，肉眼观察结果。 3.2蛋白浓度测定　 选用Lowry法测定,标准蛋白由中国药品生物制品检定所提供。 3.3电泳纯度检测　 选用非还原SDS电泳,浓缩胶4.5%,分离胶13.5%,银染法染色后,CS930扫描仪扫描,波长370μm。 3.4 HPLC纯度检测　 选用Protein-PAKl25色谱柱检测。 3.5 分子量的测定　 选用还原型SDS电泳,以Pharmacia公司分子量标准品为对照,CS930扫描仪扫描后,计算结果。 3.6紫外光谱扫描　 全波长紫外光谱扫描,读取最大吸收峰值。 3.7残余DNA含量测定 　用地高辛法测定。 3.8残余宿主菌蛋白含量测定　 用ELISA法测定。 参考文献： [1] 吴梧桐,王友同,吴文俊.21世纪生物工程药物的发展与展望.药物生物技术2000,7(2):65-70. [2] 中国生物制品标准化委员会编.中国生物制品规