细胞划痕实验详细步骤及说明.docxVIP

细胞划痕实验的详细步骤及说明 细胞迁移(cell migration)：也称为细胞移动、细胞爬行或细胞运动，是 指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。 它参与到很多生理和病理的活动中，如下： 免疫：如淋巴细胞的定向迁移是其分化成熟和发挥功能的关键之一; 炎症：炎症反应最重要的功能是将白细胞送到炎症灶，白细胞迁移到炎症 部位并发挥其吞噬和组织损伤作用; 肿瘤转移：肿瘤转移是肿瘤恶化后最常见的活动，如侵入淋巴管、血管后 随脉管系统实现远处转移; 损伤修复：当机体发生损伤时，免疫细胞和血小板会迁移到损伤部位，参 与消炎和凝血; 胚胎发育：胚胎期不同类型祖细胞迁移至特异靶位以保证各组织、器官的 正常发育。 细胞划痕实验的基本原理： 在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，边缘的细 胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合。因其类似体外伤口愈合过程，又名 伤口愈合实验(Wound-Healing Assay)，广泛用于可以观察药物、基因等外源 因素对细胞迁移和修复的影响。 细胞划痕实验过程： 在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细 胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后再继续培养细胞至实验设 定的时间(可有不同时间点)，取出细胞培养板，显微镜下观察周边细胞是否迁 至中央划痕区，并拍照。 具体实验步骤： 1. 培养板划线标记 用 marker 笔在 6 孔板背后画横线(用直尺比着)，每孔至少穿过 5 条线， 每条线均匀且平行。 2. 细胞铺板 在孔内接种约 5-10*105 个细胞(可根据细胞的生长快慢调整接种数量)，原 则为过夜后细胞能够长满，切记一定要铺匀(细胞铺板均匀技巧可参考往期内 容)。 3. 细胞划线 第二天用 20uL 枪头(灭菌)或牙签，垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标 记线相交。 Tips： 减少划痕距离的误差办法—— ●不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签; ●枪头要垂直，不能倾斜，划痕时可比着直尺; ●最好保持力度一致，尽量一次性划完。 4. 洗细胞，去除划下的细胞 划线完成后，使用无菌 PBS 洗细胞 2-3 次，去除划下的细胞，使留下的间 隙肉眼即清晰可见，然后更换新鲜无血清或低血清(2%)的培养基。 Tips： ●在用 PBS 缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞; ●为了避免细胞数量和状态受到影响，尽量不要用吸泵，可用移液枪缓慢 吸走。 5. 细胞培养与观察 将细胞放入 37℃，5%CO2 培养箱中培养。然后在适当的时间点，如 0， 6，12，24 小时后取出细胞，在显微镜下观察并拍照。 6. 数据分析 使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6 至 8 条水平线，计算细胞间 距离的均值。 注意事项 1，划痕实验一般选择 6 孔板?因为 6 孔板大小适中，可保证有相当距离的 平直划痕，便于观察;当然若是需要高通量初筛时，也可以用 12 或者 24 孔板。 2，细胞的接种密度原则一般是过夜为 100%融合，若过夜后细胞未 100% 融合，虽可以适当延长培养时间，但因细胞密度已经很大，所以细胞状态会逐 渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。 3，降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法： ① 使用无血清或低血清培养基(2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响; ② 一般认为 24h 为细胞的一个周期，在选取合适的时间点(6，12，24h)检测 划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间;③ 如果要单纯考虑细胞迁 移，可以先用丝裂霉素(1μg/ml)处理 1h，抑制细胞的分裂。 4，确保拍照的观察点固定：按照 6 孔板背后画线的垂直方向划痕，可以 形成若干交叉点，划痕一次与 5 条定位线相交，就有 10 个可固定监测点，以 解决了前后观察时位置不固定的问题。