生物 3硝酸还原酶.pptVIP

实验三 硝酸还原酶活性的测定 一、实验原理 硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶，它使N03-还原成N02-，并可渗到周围的溶液中，用磺胺显色比色法测定外界溶液中的N02-含量，可以反应该酶活性的强弱。 二、器材与试剂 油菜叶片、小白菜叶片、UV-1100型紫外/可见分光光度计、20毫升针筒 0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液、O.2M KNO3溶液、磺胺试剂、α-萘胺试剂 三、方法与步骤 1、用直径1cm的打孔器打出油菜叶圆片100片，各投50片(先称重)至溶液 (1)磷酸缓冲液5 ml + 蒸馏水5 ml； (2)磷酸缓冲液5 ml + KNO3溶液5ml 分别将溶液(1)(2)倒入20毫升针筒内，用针筒抽气使叶圆片中的空气抽去直至叶圆片沉于溶液中，将此溶液倒回三角瓶置于30℃恒温箱中，保温作用30min后测定N02-含量。 2、绘制标准曲线（见P34） 3、N02-含量测定 溶液(1)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml 溶液(2)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml 摇匀，室温静置30min显色。然后在λ520nm下测定吸光度，从标准曲线回归方程 y = 0.129 x + 0.001求出N02－含量(ug／m1)。 4、硝酸还原酶活性计算 硝酸还原酶活性(ug／h·g)=C×10/t·m(鲜重) 四、实验报告 1、比较在两种不同溶液中的硝酸还原酶活性，并解释。 硝酸还原酶将N03-还原为N02-，产生的N02-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应液中的N02-含量的多少，就表示硝酸还原酶活性的大小。 N02-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中磺胺与N02-形成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料，这种偶氮染料在520nm处有最大吸收峰，因此选用波长520nm分光光度法进行测定。 根据Lambert-Beer定律：物质对光的吸收，吸收的光量与物质的浓度、溶液的厚度成比例关系，用公式表示为 A=KLC K为吸收系数，表示物质对光的吸收特性，为定值 L为溶液厚度，比色杯直径为1cm KL为固定值，C溶液浓度越大，则吸光度越大 器材与试剂 油菜叶片、小白菜叶片、 UV-1100型紫外/可见分光光度计、20毫升针筒、打孔器、恒温箱、天平、比色皿、三角瓶、移液枪、擦镜纸、吸水纸 0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液、O.2M KNO3溶液、磺胺试剂、α-萘胺试剂、超纯水 方法与步骤 1、用直径1cm的打孔器打出油菜叶圆片100片，各投50片(先称重)至溶液 (1)磷酸缓冲液5 ml + 蒸馏水5 ml (2)磷酸缓冲液5 ml + KNO3溶液5ml 分别将溶液(1)(2)倒入20毫升针筒内，用针筒抽气使叶圆片中的空气抽去直至叶圆片沉于溶液中，将此溶液倒回三角瓶置于30℃恒温箱中，保温作用30min后测定N02-含量。 2、绘制标准曲线 用磺胺比色法测定N02-这个方法很灵敏，可以检测出0.5ug/ml的NaN02含量。吸取六个浓度的NaN02溶液，分别为0、1、2、3、4、5 ug/ml各1ml，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，然后用分光光度计进行测定。 3、N02-含量测定 溶液(1)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml 溶液(2)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml 摇匀，室温静置30min显色。然后在入520nm下测定吸光度，从标准曲线回归方程y = 0.129 x + 0.001求出N02-含量(ug／m1)。 4、硝酸还原酶活性计算 硝酸还原酶活性(ug／h·g)=C×10/t·m(鲜重) 实验报告 1、比较在两种不同溶液中的硝酸还原酶活性，并解释。 下周实验 叶绿体色素的性质测定和分离(P46-48)