原位杂交手册.docxVIP

引 言： 第 1 章 共用程序 本章介绍了本试验最基本的试验程序， 包括中期染色体制片； 质粒的转化与 DNA 的提取；探针标记检测以及基因组总 DNA 的提取 第 1 节 原生质体染色体制片 |精. |品. |可. |编. |辑. |学. |习. |资. |料. * | * | * | * | |欢. |迎. |下. |载. 试 剂： 饱和 a-溴萘、 0.075MKCl 、固定液（新奇 3：1 甲醇冰乙酸）、酶解液（ 20%纤维+2%果胶酶）、IN HCl 、95%酒精 试验步骤： 浸 种 室温下浸种约一天（也可 1-2h） 发 芽 培育皿中垫湿滤纸三层，利子分散其上，间留间隔，勿积累，种子上层掩盖一层水浸湿的滤纸， 25-30℃下发芽，每天水洗一两次，约 2-3 天可取根；NOTE ： 换水是很重要的，水不能过多，以不留流淌水为好，水分过多易长芽而根长不好； 预处理 方法 1：根长至 1.5-2cm 长时切取 1.5mm 左右的根尖， 饱和 a-溴萘约 25℃处理2-3 小时，水稻一般不预处理； 方法 2：根长好后将种子置于 4℃冰箱处理一个晚上， 其次天在 25℃下复原 2-3h， 也可得到很多分裂相； NOTE ：何进取根尖最好具随机性， 与季节以及细胞分裂时期很有关系； （玉米 8:00AM ，水稻 11:00-12:00AM ） 水 洗 反复几次 前低渗 ddH2O 或 0.075M KCl （0.6KCl 溶于 100ml ddH2O）低渗 30min（室温）；固 定 新奇 3∶1 甲醇冰乙酸固定 2-3 小时或 4℃过夜； NOTE ：肯定要用新奇固定液；假如用于石蜡切片组化显色，甲醇固定的材料会导致很高背景，应换用 4%多聚甲醛； 水 洗 反复几次，洗净； 酶 解 2%纤维素酶 +2%果胶酶混合（ 1∶1），28℃下处理 3 小时左右； NOTE ：酶解是最至关重要的一步，第一是酶的质量，很多酶都可导致分裂相少，以 SERVA 公司的果胶酶为 |精. |品. |可. |编. |辑. |学. |习. |资. |料. * | * | * | * | |欢. |迎. |下. |载. 最好，依据材料不同，酶解时间会有所变化； 洗载片 载片肯定要洁净，以防材料脱落和保持清洁的背景；洗片步骤： IN HCl 中 3min 以上 自来水洗（每片单独漂洗）接着用双蒸水洗 3）95%酒精浸泡 30min 以上（每片单独放入） 制 片 当心吸去酶液，水洗几次，吸取 1-2 个根尖于洁净的干载玻片上，滴半滴固定液，用镊子敲至浆状，滴 2-3 滴固定液使材料分散，火烤至着火； NOTE ：敲得越碎越好，敲至固定液干后，再滴固定液，快速涂开，火焰干燥，干燥后肉眼观看应为规章洁净的小雨点状，如小雨点上像有一层不透亮的薄层，说明酶解时间不够； 镜 检 检后将符合要求的制片储存于 -20℃下备用； NOTE ： 每张制片上至少应有 150 个左右分散良好但背景洁净的分裂相方可用于杂交； REFERENCES 第 2 节 质粒的转化与扩增 如寄来的探针是插在质粒中 cDNA 克隆或基因片段，第一要对其进行转化，一般利用 E.Coli 作为载体，转化的关键在于如何制备感受态的 E.Coli 细胞，本试验利用 CaCl2 来制备感受态细胞，此方法简便、快速； 试 剂： LB 培育基， 0.1M Cacl2，70%甘油 试验步骤： 感受态 E.Coli 的制备 从-20℃下取 2-5 μl E.Coli ，涂在平板上， 37℃培育 16-20h； 挑取单个菌落于 20ml 已预热至 37℃的 LB 培育基(不含 Amp) 中，37℃，300rpm 猛烈振摇约 3h； 培育物转移至 4 支预冷的 5ml Eppendorf 管,冰上放 10min，4000rpm 离心 3-5min，回收细胞（ 4℃）； 倒出培育液，倒置 lmin ； 以 5ml 预冷的 0.1M Cacl2 重悬每份沉淀，冰浴 30min；4000rpm 离心 5min（4℃）；倒出培育液，倒置 lmin ； |精. |品. |可. |编. |辑. |学. |习. |资. |料. * | * | * | * | |欢. |迎. |下. |载. 每管加预冷的 0.1MCaCl 2 0.25ml，重悬细胞，冰浴 lh 每管 100μl 分装,储存于-20℃下,长期储存转化效率会有所下降；质粒 DNA 的转化 取-20℃储存的感受态细胞二支，冰上溶解 10min，一支加质粒 cDNA(10μ l， 30ng)，混匀，另一支作为对比，冰浴 30min；42℃水浴放置 90 秒，保持 1-2min； 快速置于冰浴，保持 1-2min； 每管加 200-300μl 培育基，用