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医学免疫学实验指导:机体的天然免疫 （Natural immune of organism） 内容： 溶菌酶的溶菌作用 中性粒细胞的吞噬作用 巨噬细胞的吞噬作用 机体先天遗传形成的天然免疫力具有非特异性保护作用，主要由机体正常生理屏障、正常体液杀菌物质（如溶菌酶）、大小吞噬细胞与自然杀伤细胞（NK）等共同构成。 试验一、溶菌酶的溶菌作用 溶菌酶（lysozyme）主要由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子蛋白质，属乙酰氨基多糖酶。它的等电点高（PH 11.0），能与细菌牢固的结合，并裂解肽聚糖中N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，使细菌溶解死亡。革兰氏阴性菌肽聚糖层少，又有外膜保护，故在一般情况下不受溶菌酶的影响。 溶菌酶广泛分布于机体的组织、体液与分泌液，其中泪液含量最高，约血清的100~150倍。临床慢性支气管炎，局部免疫功能降低，唾液中溶菌酶低于正常，各种类型的白血病患者血清和尿中溶菌酶含量有所增加。 【材料】 ⒈ 唾液、泪液（或乳汁）、标准溶菌酶（1ng/ml）、生理盐水、2~5%琼脂盐水。 ⒉ 细球菌（M.lysodeikticus）。 标准溶菌酶⒊ 毛细吸管、打孔器（或滤纸片）、无菌平皿等。 标准溶菌酶 生理盐水【方法】 生理盐水 唾 液⒈ 取一无菌平皿，倾入5ml细球菌悬液，再倾入5ml已溶化的2.5%琼脂盐水,迅速混匀,平放待凝。 唾 液 泪 液⒉ 用打孔器按图 所示打孔，挑去孔内琼脂，用毛细吸管分别加唾液、泪液（或乳汁）、标准的溶菌酶和生理盐水（或用无菌圆形滤纸片分别蘸取上述四种液体，按 泪 液 图所示贴于平皿表面）。 ⒊ 37℃过夜，观察结果。 图 溶菌酶试验示意图 【结果】 孔周或滤纸片周围出现的透明圈即为溶菌环。注意比较溶菌环的大小。 【注意事项】 ⒈ 加样时，样品避免溢出孔外，孔内不应有气泡。 ⒉ 作定量检测时，先要用标准品制备标准曲线，然后根据环的直径及标准曲线求出样品含量。 ⒊ 标准曲线绘制后，每次检验样品时，最好在同一平皿上备有标准品的对照，以资比较。 【思考题】 溶菌酶的溶菌作用有什么生物学意义？ 【附录】 细菌悬液的配制：无菌吸取5ml PH6.4，1/15M PBS 加到细球菌培养管中，置室温5~10分钟。旋转培养管，制成菌悬液。用分光光度计（波长640nm）测定并调整细菌细胞浓度达到透光率为30~40%。 溶菌酶标准液的配制：称取溶菌酶标准纯品，PH6.4，1/15M PBS 配成1000ug/ml (1ng/ml)，置冰箱冻存。临用时再稀释成100，50，25，10ug/ml。 标准曲线的绘制： ⑴ 取一无菌平皿（直径9cm），倾入7.5ml细球菌悬液，再倾入7.5ml已溶化的2.5%琼脂盐水，迅速混匀，平放待凝。 ⑵ 凝固后，用打孔器打孔，孔间距约1.5cm，每平皿可打孔8~9个。 ⑶ 各孔内依次加入不同浓度的溶菌酶标准品，每孔20ml。 ⑷ 置于37℃，18~24小时。测量溶菌环的直径。 ⑸ 以溶菌酶标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），溶菌环直径为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。 试验二、中性粒细胞的吞噬作用 （Phagocytosis of neutrophilic granulocyte） 本实验将中性粒细胞与可被吞噬而又易于计数的颗粒物质（如金黄色葡萄球菌）混合孵育一定时间后，颗粒物质被中性粒细胞吞噬。计算吞噬率和吞噬指数，因此，反映该细胞的吞噬功能。 【材料】 豚鼠。 ⒉ 葡萄球菌悬液。 ⒊ 3.8%枸橼酸钠溶液、无菌注射器和针头、试管、毛细吸管、瑞氏染料、载玻片等。 【方法】 ⒈ 采集豚鼠心脏血1~2ml或取人外周抗凝血2ml，加入到装有3.8%枸橼酸钠0.2ml的试管中，迅速混匀。 ⒉ 加入葡萄球菌悬液一滴，混匀。37℃恒温箱内静置30~60分钟。 ⒊ 用毛细吸管从白细胞层（即沉淀的红细胞表面）吸取白细胞悬液，加一滴于载玻片一端，作推片，自然干燥。 ⒋ Wright 染色： ⑴ 标本自然干燥后，加瑞氏染液2~3滴于标本的涂膜上，染色1分钟。 ⑵ 加等量PBS与染液混合均匀，染色5~8分钟。 ⑶ 冲去染液。水冲时为防止染液粘附于涂膜，不能先倾倒掉染液，而要边冲边慢慢倾斜载玻片，直至染液冲尽。 ⑷ 干燥后油镜下观察。计算中性粒细胞的吞噬百分率及吞噬指数。 【结果】 油镜下见中性粒细胞核呈深紫红色，分叶明显，胞浆呈淡红色，细菌被吞入胞浆，呈紫色。随机数100个中性粒细胞，分别计数吞噬有细菌的中性粒细胞数和所吞噬的细菌总数，按照下列公式，计算出吞噬百分率和吞噬指数。 100个中性粒细胞中吞噬细胞的中性粒细胞数 吞噬百分率= ─────────────────