基因工程动物细胞培养制药工艺PowerPoint演示.pptx

第四讲 基因工程动物细胞培养制药工艺 ? 药用蛋白质的合成复杂，要有精确折叠的空间结构，要有糖基化，才能使药物发挥真正的功能。细菌和酵母等产品要么是包涵体，要么难以糖基化功能修饰。动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。 人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。 干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。 组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生长因子等。;第一节 动物细胞制药的表达系统与特征 ? 昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。? 一、哺乳动物细胞表达系统与特征 1. 动物细胞的特征 细胞膜、细胞质 和细胞核 没有细胞壁。 亚细胞器，功能独特。;2. 动物细胞代谢 动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域。通过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间的物质、信息和能量流动，通过穿梭实现不同代谢途径之间的交换。 在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合成代谢的前体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。 葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿，反之亦然。谷氨酰胺是动物细胞的氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其他氨基酸的消耗得以补偿。 ;糖代谢特点： 动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。 丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底氧化产生CO2和水。小部分（4％～8％）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。 葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。 ;氨基酸代谢特点： 吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。 大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷???酰胺通过转氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。 谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物α-酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。 ;不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰胺。 在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以ATP和NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。 常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。 ;3. 蛋白质糖基化 蛋白质合成是以mRNA为模板，在核糖体上完成。而蛋白质的糖基化无需模板指导，因此糖蛋白的寡糖结构容易发生变化。 糖蛋白的单糖单元:α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、α-D-甘露糖、α-D-木糖、α-D-岩藻糖、N-乙酰-α-D-葡萄糖胺、N-乙酰-α-D-半乳糖胺和α-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸）。 糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为N-糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化的位点和数量及糖的种类都不同。;N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体的保守序列为Asn-X-Thr/Ser (X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)。如果X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影响，而第三位Thr能增强糖基化。 N-糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共同核心是3个甘露糖和2个N-乙酰葡萄糖胺组成的5糖（Man3GluNAc2），其他糖形成支链。 高甘露糖型的支链为甘露聚糖（5～9聚体），无其他糖。 复合型含有2个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。 杂合型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。;O-聚糖连接在Thr/Ser的羟基上，还没有发现保守序列。 O-聚糖有四种不同的核心结构，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。 O-糖基化比较小，一般为1～6个寡聚糖，但比N-糖基化变化更大。 O-糖基化只在高尔基体上进行，糖基单元有木糖、葡萄糖。 ;糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定的相互作用，都具有相同的核心结构：胆胺-PO4-Man2-GlcHN2-肌醇-PO4-脂。 胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。 在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割此类蛋白，有利于纯化。 ;细胞特异性糖基化途径——淋巴细胞中进行，它不依赖于内质网和高尔基体。 IgG的糖基化，等分G