生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制.pptxVIP

4、工业微生物育种 生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 不会有代谢产物的积累 解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物积累方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）微生物育种的目的4.1从自然界中获得新菌种 微生物资源分布土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所 分离微生物新种的步骤 采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。 典型的微生物采样和筛选方法 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产 菌种选育突变、体内重组体外重组（基因工程）4.2 诱变育种 物理诱变紫外线 化学诱变5-溴尿密啶 4.2.1 紫外线诱变 机理造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应 研究的比较清楚交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。 引起DNA复制错误 嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多 胸腺嘧啶二聚体 嘧啶的紫外线光化产物诱变过程中需要注意光复活作用 微生物等生物的细胞内存在光复活酶 此时的光复活酶没有活性光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物可见光光能（300-500nm）激活光复活酶打开二聚体，将DNA复原。 PRE为光复活酶 暗修复 细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活 可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。 暗修复体系有四种酶参与反应。 核酸内切酶切开二聚体的5’末端,形成3’-OH和5’-P的单链缺口 核酸外切酶从5’-P到3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口 DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-OH 端起合成缺失片段 连接酶将新合成链的3’-OH与原链的5’-P相连接 紫外诱变的特点 方便、诱变效果很好的常用诱变剂 在红光下操作或暗培养 参数：紫外灯功率、工作距离、照射时间4.2.2 5-溴尿嘧啶诱变——碱基类似物 机理：与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应 酮式的5-BU结构与胸腺嘧啶相似 ，与A配对 5-BU很容易进行酮式与烯醇式结构的互变异构 烯醇式5-BU不与A而与G配对 参数：浓度、时间、缓冲液A：T?G：C 诱变育种的基本过程如下： 合适诱变剂量的选择在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。 出发菌株的选择一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。 自然界直接分离到的野生型菌株 菌株来源经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株 其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。 制备菌悬液 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。 一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。 悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。 用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。 产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢 菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞106?107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。 诱变处理 合适诱变剂量的选择在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。 就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。致死率在70%-80% 诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。 4.2.2 菌种筛选的策略 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求初筛：要力求快速、简便 复筛：应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平 (1)从菌体形态变异分析——初筛有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。 纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。——定性或半定量用 ，大大提高筛选的效率 ——初筛微生物特异性平板检测方法 固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质 指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养