分生试验技术课件实验四.pptxVIP

实验四;1.掌握Southern blotting的原理和方法 2.了解探针标记的原理和方法;一.Southern blotting 二.探针标记;印迹技术 ;类型;转膜方法;中文名称;核酸/蛋白质的制备;DNA印迹技术;制备样品DNA;凝胶;（一）探针的概念 是带有特殊可检测标记的核酸片段，它具有已知的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，可以用于检测核酸样品中的特定核酸片段。; ⑴. DNA探针; 探针标记物 (Marker of probe) ①.（放射性）核素/同位素标记物 ;标记方法;探针标记方法 根据标记的位置不同可以分为： 末端标记 (Ending Labeling) 标记物位于探针的3’末端或5’末端 均一标记 (Uniform labeling) 标记物位于探针内部;化学标记法;缺口平移法(nick translation) 随机引物法(random primer labeling) 末端标记法 PCR标记法;;;1.制备样品DNA 2.限制酶酶切DNA分子 ; 本实验采用实验一制备并保存的小鼠基因组DNA; 取3支1.5mL离心管，按照下表所列加组分加入相应试剂： ; (二）PCR扩增 以阳性重组质粒为模版扩增目的DNA(G6PD);1. 样品准备： 取上述准备的样品上样，基因组DNA（20μL）\PCR （10μL） 、MARKER （5μL）;;2. 电泳 调电压100V,电泳40分钟左右，紫外灯观察电泳结果，照相保存。 ;（为杂交做准备） 方法:随机引物标记法 用酶标亲和素进行检测 DNA 模版为纯化的PCR产物 ;第一天;1.脱嘌呤：将琼脂糖凝胶块浸泡入10倍体积的0.25M HCL中振摇5min ，至溴酚蓝条带转变为黄色，继续振摇5min 2.变性：去HCL溶液，加入10倍体积变性液，振摇20min；更换变性液，再振摇20min 3.漂洗：去变性液，用蒸馏水漂洗一遍 4.中和：加入5倍体积中和液，振摇20min，更换中和液，再振摇20min ;1.准备转移模板 2.准备硝酸纤维素膜 3.过夜转移 ;1. 标记：取下硝酸纤维素膜，标记含DNA面和方位 2. 漂洗： 2×SSC，漂洗 3. 干燥： 滤纸上晾干后，于80℃烤箱，烘烤60~120min。立即用于杂交或封存于塑料袋中于4℃保存备用 ;将硝酸纤维素膜漂浮于6×SSC液面 完全浸透，浸泡于其中 立即取出，封入塑料膜中 留有空隙侧剪开一角，汲去多余液体，加入预杂交液 （0.1-0.2mL/cm2) 驱净气泡，封闭塑料膜 42℃保温0.5~1h;;剪开有空隙侧的另一角，加入变性处理???的标记探针 驱除气体，封口 反复颠倒混匀杂交袋 42℃保温过夜;取一个盘子，加入2×SSC-0.1%SDS 100mL 取出杂交袋，快速取出硝酸纤维素膜 立即转移入2×SSC-0.1%SDS中，轻轻振摇，漂洗5min 换2×SSC-0.1%SDS，再漂洗5min 用0.2×SSC-0.1%SDS，50℃漂洗15min ;将干燥的硝酸纤维素膜漂浮在50mLTBS缓冲液上震摇5min 转移入10ml 封闭液中 37℃振摇30-60min;去除封闭液，加入10mLTBS 按比例加入辣根过氧化物酶酶标链亲和素 （1-5μL/mLTBS） 25℃振摇保温30~60min;1.漂洗 25mL漂洗液中振摇5min，漂洗三遍 2.显示 沥去液体，加入显色液，轻轻振摇至显色深度不再增加，放入水中漂洗，停止显色 3.照相 4.干燥：滤纸上干燥，保存;