ELISA酶联免疫吸附试验报告.pdf

大学实验报告 酶联免疫吸附试验 学院： 专业： 姓名： 学号： 一．实验原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将 抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术， 可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。基本原理如下：①先使用抗原或 抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联 结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保 留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不 同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离 物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。当加入酶反 应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。颜色反应深浅与受检抗原或抗体的 量成正比。因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。本技术的特 点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。 图 1 ELISA 实验原理示意图 二．实验材料 BSA 抗原、兔抗 BSA 抗体（一抗，分别用 PBS 稀释成 1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔 IgG （二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓 冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H SO 。 2 4 三．实验方法 1.包被板的处理：加 BSA （包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100 μl，置湿盒中 4℃过夜。第二天取出，用 PBS 洗涤 3-4 次。 2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入 100μl PBS 作阴性对照，在第 2-8 孔加 入上述稀释的一抗各 100μl，置 37℃保温 1h。 3.倾去液体，用 PBS 洗涤 3-4 次后加入二抗各 100μl，置 37℃保温 30min。 4.倾去液体，用 PBS 洗涤 3-4 次后加入底物溶液各 100μl，在暗处 37℃避光显 色 20min，最后加入 50μl、2M H SO 终止反应。 2 4 5.在波长 490nm 处，测定各孔的光密度吸收值。 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程 度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。 也可测 O·D 值：在检测仪上，于 490nm 处，以空白对照孔调零后测各孔 OD 值， 若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性。 四．实验结果 表 1 酶联免疫吸附 OD 值检测表 加样孔 Max 与 1 （阴性 2 3 4 5 6 7 8 阴 性 对 对照） 照 OD 值 组别 之比 A 0.416 0.386 0.354 0.405 0.444 0.390 0.739 0.531 1.78 B 0.515 0.409 0.429 0.471 0.429 0.388 0.294 0.440 0.91 C 0.657 0.567 0.496 0.892 0.508 0.334 0.278 0.255 1.36 D 0.373 0.371 0.779 0.350 0.51