第二章基因工程制药.pptxVIP

内容;第五节 基因表达;概述;基因工程对宿主细胞的要求;大肠杆菌 枯草芽胞杆菌 链霉菌 常用有酵母 丝状真菌 哺乳动物细胞;大肠杆菌;4、大肠杆菌的表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产 物不能糖基化，因此，在应用上受到一定的限制。 5、目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。 6、大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。;真核基因在大肠杆菌中的表达形式;1、分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。 2、产物蛋白质不能糖基化。 3、有很强的胞外蛋白酶对产物降解。因此，它的应用也受到限制。;链霉菌;1、基因组小，世代时间短，无毒性； 2、繁殖迅速，可廉价的大规模培养； 3、能外分泌，简化了分离纯化工艺； 4、产物可糖基化； 5、已有不少真核基因成功表达。（干扰素、乙肝抗原）;1、分泌能力强； 2、能正确进行翻译后加工（肽剪切和糖基化），而且糖基化方式与高等真核生物相似； 3、有成熟的发酵和后处理工艺； 4、丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠。;1、使产物纯化变得容易。 2、产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。 3、动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。 4、表达的外源细胞均为传代细胞，表达产物是否致癌尚有疑问。; 主要基因工程表达体系比较;第六节 基因工程菌的稳定性;质粒稳定性的分析方法;工程菌的培养过程： ①通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； ②通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案和顺序。;;一、基因工程菌的培养方法;3.透析培养： 利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养基中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。 4.固定化培养： 将固定化技术用于工程菌的培养，质粒稳定性大大提高，特别是对分泌型菌种。;二、基因工程菌的发酵工艺;1、培养基的影响 碳源对菌体的生长和外源基因的表达有较大的影响。如以甘油为碳源，菌体得率较大，而以葡萄糖为碳???菌体产生的副产物较多。 葡萄糖对lac启动子有阻遏作用,采用流加措施,控制培养液中葡萄糖的较低浓度,可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。;碳源： 葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 氮源： 酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。 其他： 无机盐、微量元素维生素、生物素等。 ;2、接种量的影响 接种量：指移入的种子液体积和培养液体积的比例。 比例大小响发酵的产量和发酵周期。 接种量：量过小，延长菌体延迟期，不利于外源基因的表达，采用大接种量，由于种子液中含有大量水解酶，有利于对基质的利用；量过大，使菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。;3、温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子的合成水平上。 4、溶解氧的影响 溶解氧是发酵培养中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。维持较高水平的DO2值 （40%）有利于重组质粒细胞的生长及外源蛋白产物的形成。;5、诱导时机的影响 一般在对数生长期或对数生长后期进行升温诱导表达。 6、pH的影响 如采用两段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳生长条件，培养后期着重于优化外源蛋白的表达条件。细胞生长期的最佳pH范围在6.8-7.4，外源蛋白表达的最佳pH为6.0-6.5。;三、基因工程菌的培养设备 发酵罐 组成：发酵罐体、搅拌器、温度控制系统、灭菌系统、空气过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制及连续操作装置。;第八节 基因工程药物的分离纯化;概述;;(1)目的产物在初始原料中的含量较低; (2)含目的产物的初始物料组成复杂； 除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；;(3)目的产物的稳定性差； 具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性 (4)产物种类繁多； 包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质。 (5)应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。;分离纯化工艺的根据;（3）生产工艺和条件： 包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等； （4）初始物料的物理、化学和生物学特性： 包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。 2、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构