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流式细胞术课件;第一节  流式细胞术概述;流式细胞术; 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的构造及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子程度上获取多种信号对细胞进展定量分析或纯化分选。 ;流式细胞仪;BD LSR; 通过流式细胞仪我们可以得到以下信息 - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度;;根底研究;临床研究;第二节流式细胞仪工作原理;采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色??与激发效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进展数据处理分析，保证了检测速度与统计分析准确性。 ;根本工作原理;单细胞液柱;现代流式细胞仪包括;由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 ;液流系统;;FCM的液流系统〔如何形成单个细胞流〕;激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字穿插放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS〔散射光〕， FL1, FL2, FL3, FL4〔荧光〕;;流式细胞仪的光信号;(2) 散射光信号;前向角散射光 ——FSC;侧向角散射光——SSC;散射光;散点图——Dot Plot;;荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器;荧光信号;荧光检测器;;4. 细胞分选系统;Fluorescence Activated Cell Sorting;第三节流式细胞术数据显示;FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部构造复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少;单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析;双参数直方图点图;第四节流式细胞样品制备;标本来源： 外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他实验的不同，选用不同的抗凝剂。;标本处理时间：;第五节流式细胞荧光标记;选择适宜的荧光染料;抗体使用原那么;;;第六节凋亡细胞的检测;细胞在凋亡时产生的一系列形态学、生物化学及分子生物学性质的变化,包括细胞皱缩,核染色质凝聚,细胞膜通透性改变,诱导蛋白酶凋亡分子激活,线粒体跨膜电位降低,膜磷酯酰丝氨酸外化,胞质Ca2+浓度升高,DNA片段化及含量变化等特点,进展定性、定量测试分析,从而实现对细胞凋亡的准确测定。 ;Flow cytometry of apoptotic cell death;Flow cytometry of apoptotic cell death;Flow cytometry of apoptotic cell death;Flow cytometry of apoptotic cell death;Flow cytometry of apoptotic cell death;Flow cytometry of apoptotic cell death Phospholipid redistribution;2021/1/12;第七节细胞周期的检测;原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。〔n----2n〕;G1 期细胞主要进展 RNA 和蛋白的合成, DNA 数目为 n.S 期 DNA 开场复制，直到复制完毕进入 M 期，DNA 数目从 n 变为 2n.G2 期主要是 RNA 和蛋白的合成,为 M 期做准备 DNA 数目为 2nM 期细胞分裂的过程，直到 M 完毕细胞一分为二，DNA 数目也是 2n，分裂后期DNA数目变回n。从 DNA 的数目上，我们可以将细胞周期分为 G0/G1 期，s 期，G2/M 期;一般利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图来表示，假如 G0/G1 期处于 50 的位置，那么 G2/M 期处于 100 的位置。期间的为 S 期;Flow cytometry of cell cycle;THANK YOU;谢谢欣赏