ELISA结果影响因素.ppt

结果影响因素——操作因素 正常情况下的双抗体夹心法ELISA反应 一步法抗原过量时出现钩状效应 特点：不易发现 对结果的影响： 强阳性 → 假阴性 解决方法：标本稀释 第二十一页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 结果影响因素——操作因素 [2]王珂等.ELISA法测梅毒螺旋体抗体钩状效应2例分析.中国误诊学杂志.2008Vol8No.33. 表2 不同血清稀释度下的S/OD值（OD值为0.105） 项目 原倍 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 标本1 0.92 3.77 8.11 12.25 15.24 17.88 16.34 10.88 7.58 标本2 0.63 2.59 4.83 5.82 10.03 7.49 5.78 3.95 2.60 第二十二页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 温育（成败关键） 每种试剂都有其最佳反应模式，其中温度和温育时间是重要因素。 结果影响因素——操作因素 [3].刘运保.操作因素对ELISA检测结果的影响.公共卫生与预防医学.2005.Vol.16.No.4 表3 不同孵育条件对结果的影响 第二十三页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 [4]许萍等.不同温育环境ELISA检测抗—HCV的比较.临床检验杂志.2002.Vol.20.Mo.3 A.1、2、3全部在雅培鼓风式恒温系统温育 B.1、2、3全部在水浴恒温箱温育 C.1、2干式3水浴 D.1、2水浴3干式 E.1水浴2、3干式 F.1干式2、3水浴 G.1水浴2干式3水浴 H. 1干式2水浴3干式 1.反应板中加待检样品37℃60min2.加酶标记物37℃60min3.加底物溶液37℃30min 表4 不同温育条件下的检测结果 第二十四页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 结果影响因素——操作因素 边缘效应 使用96孔板的ELISA测定中，常发生“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温置于37℃温箱(非水浴)，板孔升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。 所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。?另外，酶标板也是一个比较重要的因素，选择质量好一点的板能一定程度减少板内误差。 第二十五页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 * 第一页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 主要内容 一、 ELISA简介 二、ELISA试验结果影响因素 第二页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 ELISA简介 ELISA(?EnzymeLinked?Immunosorbnent?Assay?)是酶联接免疫吸附测定的简称。是一种免疫学测定方法，主要通过抗原抗体反应检测液体标本中目的蛋白性质、功能及含量。 第三页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 ELISA实验原理 抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性并能相互特异性结合。 抗原抗体复合物与酶标二抗结合， 加入合适的底物，在酶的作用下显色， 颜色深浅与特异性抗体成比例关系， 可进行定性和定量分析。 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 第四页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 ELISA检测方法 抗原测定方法 抗体测定方法 双抗体夹心法 竞争法 双抗原夹心法 竞争法 间接法 第五页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 主要操作流程 + 已知抗体 包被于载体表面 加待检物 无抗原与抗体结合 洗涤 洗涤 洗涤 洗涤 - Y Y Y E Y E Y E Y Y E Y E Y E Y Y Y Y E Y E Y E Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 已知抗体 包被于载体表面 加待检物 抗原与抗体结合 加酶标抗体 与抗原结合 加酶作用的底物 产生颜色 加酶标抗体 与抗原结合 加酶作用的底物 不产生颜色 双抗体夹心法测抗原 第六页，编辑于星期四：二十二点 四十三分。 ELISA结果判定 1.定性测定? (1)肉眼观察：比较检测孔与对照孔的颜色。 (2)阳性判定值法(cut-off value，CO值)：一般为阴性对照的平均A值加一个常数，标本A值≥CO值即为阳性。 (3)抑制率法：在竞争抑制法中结果可用抑制率表示。 抑制率(％)＝(阴性对照A- 待测A)／阴性对照AX100％,一般以抑制率≥50％为阳性 2.半定量测定 ?结果一般以滴度表示。将标本连续稀释后，进