论甲霜灵胶体金竞争法试纸条的研制.pptx

甲霜灵胶体金竞争法试纸条的研制 ;一、前言;1.农药甲霜灵简介;2.最大残留限量标准;中华人民共和国国家标准甲霜灵在食品中最大残留限量标准;3.检测方法建立;胶体金免疫层析诊断技术是在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员操作等特点，真正达到复杂原理与简易操作的统一；同时具有保存方便，有效期长等特点。 与气相色谱法补充使用，具有灵敏度高、操作简便、检测迅速等特点。 ;主要技术路线;4.分课题情况简单汇报;课题完成情况及效果 ： 本课题已成功研制出合成免疫原N2B，进行免疫获得单克隆抗体N2B1 4E6C10,这一针对甲霜灵抗原决定簇配对的单克隆抗体，亲和力好，效价达到10-9，并成功制成甲霜灵胶体金检测试纸，应用竞争法胶体金检测试纸最低检出量可达0.3mg/kg，达到国标要求。通过比对试验的验证，相关系数r=0.99996，说明方法的可靠性。因此，可以肯定胶体金免疫法在农药、兽药残留限量快速检测技术中，是最有效、最快速、最简便的方法。其优点在于灵敏度高、特异性强、操作简便、快速、常温储存等，是适合于现场检测的一种快速检测方法，是食品安全检测的一种手段，互补现有检测方法各自的优缺点。 ;二、试验研究内容;1.免疫原合成;（1）半抗原合成;（2）免疫原合成;（3）免疫原的鉴定;琼脂糖双扩散法鉴定 ;（4）小结;2.抗体制备;（1）单克隆抗体制备;单克隆抗体制备流程;用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在无菌条件下取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，共融合6次，每次1只。用ELISA间接法从产生的267株阳性杂交瘤中，筛选出对甲霜灵抗原呈阳性反应的杂交瘤11株，注射小鼠185只，制备腹水419mL，纯化得到275.8mg抗体。结果表明：我们成功获得了能识别甲霜灵抗原决定簇的杂交瘤细胞株：N2B1 4E6C10。;单克隆抗体鉴定;②间接ELISA法检测抗体活性 ;③间接ELISA法抗体特异性检测 ;④抗体亲和力的鉴定 ; 单抗 ; 用甲霜灵抗原包被直接筛选，结果显示：N2B1 4E6C10能识别甲霜灵抗原决定簇；经Protein A柱直接纯化，亚类为IgG1的这株抗体纯度达到95%以??；抗体亲和力常数（6.72±0.507）×109，可以满足用于制备检测试纸的检测线。 ;（2）多克隆抗体制备;过程：; ; 羊抗鼠多克隆抗体，经活性鉴定合格，可以满 足用于制备检测试纸的控制线。 ;3.胶体金研究;4.半成品研制及鉴定;在硝酸纤维素膜上的检测区包被甲霜灵合成免疫原，对照区包被羊抗鼠多克隆抗体。当待测物中有被测的抗原物质（即甲霜灵）时，待测物中的抗原物质就会与标记胶体金的甲霜灵单克隆抗体形成Ag-Ab-Au复合物，复合物不与包被在硝酸纤维素膜上的甲霜灵合成免疫原结合，仅会在控制线处出现一条色带（C线），结果为阳性，说明被检测的样品中农药甲霜灵超标。当待测物质中没有被测的抗原物质时，标记胶体金的甲霜灵单克隆抗体就会与包被在硝酸纤维素膜上的甲霜灵合成免疫原结合，形成Ag-Ab-Au复合物，此时检测线处可看到一条明显色带（T线），因此当检测试纸上可看到两条线（C线和T线）时，结果为阴性，说明被检测的样品中农药甲霜灵未超标。 ;胶体金检测试纸条制作工艺流程; 调试日期 ;① 敏感性鉴定 取甲霜灵竞争法试纸条，依次浸入蒸馏水、浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜灵标准品中，5分钟内各试纸条均可见一条红色的控制线，其中蒸馏水和浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜灵标准品在检测区和控制区均可见一条色带，为阴性；而浓度为300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜灵标准品仅在控制区出现一条色带，为阳性。 ;;② 阳性参考品符合率鉴定 取甲霜灵竞争法试纸条，依次浸入浓度为300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜灵标准品中，5分钟内各试纸条仅可见一条红色的控制线，为阳性 。;;③ 特异性鉴定 取甲霜灵竞争法试纸条，依次浸入浓度均为100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敌百虫、林丹、绿麦隆、甲基对硫磷、禾草灵、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津样品中，5分钟内各试纸条在检测区和控制区均可见一条色带，为阴性 。;; ④ 精密度鉴定 取甲霜灵竞争法试纸条，依次浸入300ng/mL的甲霜灵标准品中，同批次、不同批次各平行检测10条，5分钟内各试纸条均可见一条红色的控制线，为阳性 。;;⑤ 稳定性鉴定 胶体金检测试纸条37℃放置20天稳定性试验 胶体金检测试纸条4～30℃