中国林蛙皮肤抗菌肽基因的cDNA克隆.docxVIP

— PAGE \* Arabic 1 — 中国林蛙皮肤抗菌肽基因的cDNA克隆 ６４６中国兽医学报２００６年１１月第２６卷第６期ｃ＾抽。，ｙ“５ｆｉＮｏｖ．２００６Ｖ０１．２６Ｎｏ．６中国林蛙皮肤抗菌肽基因的ｃＤＮＡ克隆  乔红伟１，韩俊友ｏ，赵瑞利１，郑伟２，韩艳１，韩文瑜卜（１．吉林大学畜牧兽医学院．吉林长春１３００６２；２．吉林省水产研究院，吉林长春１３００６２）   中国兽医学报２００６年１１月第２６卷．第６期Ｃ＾锄Ｊｙ甜ＳｃｉＮｏｖ．２００６Ｖ０１．２６Ｎｏ．６６４７  图１中国林蛙皮肤总ＲＮＡ电泳结果１，２．３．ＲＮＡ  图２ＲＴ—ＰｃＲ电泳结果１．扩增的目的条带２６１ｂｐ；２．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ  通过与相近无尾两栖类抗菌肽序列进行比较。发现序列为一个新的蛙皮肤抗菌肽序列。总共有５３个氨基酸残基，个别氨基酸为Ｄ一氨基酸，Ｃ端有酰胺化修饰，且序列与相近无尾两栖类抗菌肽序列同源性为８０％。  ２．３活性检测结果先从大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌、白色念珠菌、链球菌中筛选出对提取皮肤活性物质敏感的受试菌，对其中金黄色葡萄球菌、李氏杆菌、绿脓杆菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌、链球菌有抑菌作用。以李氏杆菌作为受试菌，分别将抗生素按不同浓度稀释，进行抑菌实验，抑菌环大小表明当氨苄青霉素（２０ｐＬ）、卡那霉素（２０ｐＬ）、环丙沙星（２０ｐＩ。）、四环素（２０弘Ｌ）时的抑菌环直径为２０ｍｍ。与５０”Ｉ。抗菌肽的抑菌环直径大约相等。  图３抗菌肽活力单位的测定１．氨苄青霉索（２ｌｍｍ）；２．卡那霉素（２０ｍｍ）；３．环呙沙星（２０ｍｍ）；４．四环素（２２ｍｍ）；５．  抗菌肽活性物质（】９ｍｍ）；６．ＰＢＳ（Ｏｍｍ）  ３讨论  在脊椎动物演化过程中，两栖动物是由水生到陆生的过渡型，其中很多物种具有食用或药用价值，两栖动物皮肤在自然进化过程中形成了防御病原微生物的３套防御系统．相应地具有特定结构。皮肤抗菌肽是其中先天性防御系统的主要组成部分，两栖动物皮肤抗菌肽具有高效、广谱、不易产生耐药性等特点。这使其在耐抗生素病原菌株大量涌现的今天有望成为新一代的临床抗菌药物，并成为当前耐药性研究的热点。  目前在ＧｅｎＢａｎｋ中收录的有关无尾两栖类抗菌肽的核苷酸序列与蛙皮肤抗菌肽相似的也不少；来自于ＡＪ２５１５６６，ＡＪ４２７７４６，Ｓ６９９０３，ｕ２２３９２．ｘ７７８３ｌ，Ｙ０９３９３等，它们大约都在３１０ｂｐ左右，有一个完整的开放阅读框（（）ＲＦ）它们的ｏＲＦ在氨基酸８２～３８０ｂｐ之间。它们之间的同源性在８０％左右。因此，对于证明来自于蛙皮肤抗菌肽的确定的氨基酸序列是非常必要的。  最近有研究表明，蛙皮抗菌肽链一般有１１个氨基酸残基到４７个氨基酸残基构成。除了Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｎ为２条链外，其他的蛙皮抗菌肽都是１条肽链。有些肽的个别氨基酸为Ｄ一氨基酸；有些肽在ｃ端有酰胺化修饰；部分蛙皮抗菌肽含有２个半胱氨基残基，形成含有１个二硫键的分子．除Ｔｉｇｅｒｎｉｎ一１分子的二硫键包含９个氨基酸残基。Ｊａｐｏｎｉｃｉｎ一２分子的二硫键包含８个氨基酸残基外，其余蛙皮抗菌肽分子的二硫键都只包含７个氨基酸残基。几乎所有的蛙皮抗菌肽分子都含有较多的亮氨酸和异亮氨酸残基，所以是疏水肽；同时也含有一些精氨酸和赖氨酸残基，因而是阳离子肽。绝大多数肽分子在水溶液中为无规则卷曲构象，在亲脂性溶液中（如５０％的三氟乙醇溶液）或接触到平面双层时，多数氨基酸残基形成两亲ａ一螺旋，两亲ａ一螺旋可以用ａ一螺旋轮来表示［６“］。  本试验从中国林蛙皮肤中直接证实了蛙皮抗菌肽的存在。用ＲＴ—ＰｃＲ的方法可以从直接得到大约４ｎｇ的蛙皮肤ｍＲＮＡ中，得到１条高清晰度的大约３１０ｂｐ的单链条带，在１％的琼脂糖凝胶电泳中可以得到证实。估计蛙的皮肤抗菌肽占蛙皮肤总蛋白的４％左右，另外，通过抑菌试验，利用内插法的二次回归模型在固相培养基上对浓缩的蛙皮肤抗菌肽进行活性检测，推测它也具有蛙皮抗菌肽的生物活性。总之。中国林蛙成熟的蛙皮抗菌肽ｃＤＮＡ序列已经确定，并且它的活性也已经证实。这个结果将对在外界压力下、病毒的感染或者在免疫刺激剂的影响下．抗菌肽基因的表达研究非常有价值。   ６４８中国兽医学报２００６年１１月第２６卷第６期ｃＪＩｌ砌￡，ｙ“ＳｃｉＮｏｖ．２００６Ｖ０１．２６Ｎｏ．６  ｅｎｃｅ），１９９５，３７：１０５—１２２．［Ｊ］．ＢｉｏｐｏＩｙｍｅｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓｃｉｅｎｃｅ），１９９８，４７（６）：４１５—４３３  ［８］ＡｎｄｒｅｕＤ，ＲｉＶａｓＬ．Ａｎｉｍａｌａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａ