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Western Blot基本原理、过程及注意事项 Western Blot根本原理、过程及留意事项原理是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进展检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进展检测，对新基因的表达产物，可通过融合局部的抗体检测。主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测。样品的预备样品种类主要有培育的细胞、组织〔需磨碎〕、特别细胞〔切割下来的肿瘤细胞〕等。1、裂解液主要有RIPA和三去污两种，RIPA适用于细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总蛋白。三去污又分为离子型和非离子型。离子型的裂解力量较强如SDS等，非离子型的包括NP-40、Tritonx-100。2、裂解液的成分，3、样品缓冲液sample buffer备注：1、样品应保持低温，且试验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。裂解完后样品液会显得粘稠是长构造DNA所致，故需要匀浆，打断DNA。一般不用超声，因为简单引起蛋白不行逆的变性。2、用2X样品缓冲液与样品1：1混匀。4度保存。3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并快速插入冰中，以充分变性蛋白。配胶：胶的主要成分为丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。4、分别胶的配方：以20ml的8﹪分别胶为例：5、浓缩胶配方：6ml为例备注：1、制胶是避开产生气泡，空气会影响胶的聚合，在蛋白质表观分子量分析时影响大。2、因为有SDS，每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。3、蛋白简单与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中参加SDS为了给蛋白持续的负电荷。4、垫条清洗洁净，与制胶板压紧，避开漏胶。5、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面，其作用：可以平衡胶面，赶气泡等。胶固定后用滤纸吸除洁净，有水跑胶时条带会歪。6、先插梳子再灌浓缩胶。溴酚蓝快跑出胶时停顿。转膜依据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择适宜材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹试验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发陌生水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。依据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越坚固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。大于20kD 的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm 的膜就会发生“Blowthrough〞的现象。PVDF膜灵敏度、辨别率和蛋白亲和力比常规的膜要高，特别合适于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在用法之前必需用纯甲醇浸泡湿透。装配转移依据三明治原那么：海绵→层滤纸→胶→膜→层滤纸→海绵。膜应先浸入纯甲醇湿透。每层放好后，加紧夹板。切记：将转移槽置于冰浴中，放入“三明治〞〔黑色面对黑色面〕，加转移缓冲液，插上电极，250mA，2h。留意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。转膜完毕后，切断电源，取出蛋白膜。备注：1、整个过程保持膜的潮湿不能干掉。干会产生气泡。转膜时气泡处蛋白会跑向旁边。2、膜入甲醇时斜而慢，避开产生气泡。3、转膜缓冲液一般不加SDS，但大槽时因导电性差需加少量，加甲醇用于维持膜与水的相亲性。4、由于甲醇易挥发，参加15﹪-20﹪甲醇时应带盖混匀。5、三明治插到槽中时，槽中需要有液体。6、电流不能过高，高电流易产热，过热会使条带扩大。封闭1．用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。2．置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。备注：1、封闭缓冲液可用0.5%牛血清白蛋白，但价贵。常用5%脱脂奶粉。2、封闭的作用是结合膜上其他的活性位点，防止抗体与之结合。3、一般室温轻摇1-2h，也可以4度过夜，或者37度0.5h〔一般背景会高〕。免疫杂交与显色1．15ml TBS/T洗3次〔5 min/T〕。2．参加适宜稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。3．15 ml TBS/T洗3次〔5 min/T〕。4．参加适宜稀释度的碱性磷酸酶〔AP〕或辣根过氧化酶〔HRP〕标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。5．15 ml TBS/T洗3次〔5 min/T〕。6．15 ml TBS洗1次。7．蛋白检测(显色法或发光法)。备注：1、稀释的抗体可用