SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量; SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物生物化学实验技术教学中一个重要实验之一。; 能够带动生化实验技术综合型实验项目的开设。  如：蛋白质盐析沉淀提取 → 葡聚糖凝胶层析分离→ DEAE-纤维素分离提纯蛋白质 → 蛋白质纯度鉴定、蛋白质分子量测定等。;一、实验目的;二、实验原理 ; 区带电泳使用不同的支持介质，有滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。; ; 2.不连续系统：由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 ; ; 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。 蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此在进行电泳时，;蛋白质分子移速度取决于分子大小。当分子量在15000KD到200000KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。合下式： ，式中  将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。;图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 ; 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，必须完全打开蛋白质之间的二硫键，使蛋白质分子被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上。因此在用SDS处理样品同时用巯基乙醇处理。巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。; 三、 实验试剂和器材; 2. 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中  3. 10%SDS（十二烷基磺酸钠） 4. 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g（PH计）; （7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液  250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。;实验器材; 四、实验过程 如：免疫球蛋白G 分子量的测定 （一）血清γ-球蛋白的提取  硫酸胺盐析沉淀法   （二） γ-球蛋白脱盐纯化  葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到γ-球蛋白（去年完成的基金项目）  （三）纯化免疫球蛋白G  DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G。 （四） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定血液免疫球蛋白G的分子量（ 连续四个单项实验）。 ;; C.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,  D.加样（摸索加样量） 取10μl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10μl 2倍样品缓冲液，上样量为20μl。 取10μl样品溶液，再加入10μl 2倍样品缓冲液，上样量分别为5μl 和10μl。 E.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。; F.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在8mA，（电流、电压）当进入分离胶后改为16mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。  G.凝胶板剥离与染色 电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色 过夜。 H.脱色