蛋白质从头测序与传统测序方法.pdfVIP

浅谈：蛋白质从头测序与传统测序方法 什么是蛋白质从头测序？ 蛋白质从头测序是一种不依赖于任何已知的序列或者蛋白质数据库信息， 直接对蛋白质氨基 酸序列进行测定的全新测序技术。 蛋白质从头测序原理 蛋白质从头测序的原理： 基于蛋白酶切后的肽段分子在质谱检测中有规律性的断裂， 找到特 定断裂模式， 再根据质谱峰之间质量差计算出对应的氨基酸信息， 以及氨基酸上的翻译后修 饰。 为何要使用从头测序对蛋白质进行分析？ 使用传统方法分析蛋白质时， 无论是基于 MALDI-TOF 质谱仪还是 nanoLC-MS/MS 平台， 鉴定 蛋白的过程中都需要借助包含被鉴定蛋白在内的序列数据库， 再将质谱测定的数据与数据库 理论序列碎裂之后得到的分子量数据进行比对， 才能够完成对蛋白质样品的测序和鉴定。 但 是，在实际情况中， 我们收到的蛋白质样品中， 其序列信息可能并未包含在已有的数据库内， 比如一个我们还未发现过的全新蛋白， 或者从一个新物种中提出出来的蛋白。 此外， 很多时 候我们能够得到的理论数据并不全面， 未得到的部分往往才是关键。 比如市场上某种经过序 列改造的酶， 竞争对手想要通过逆向工程获取酶的完整信息就存在很大的困难， 因为酶的序 列变化是多种多样的，包括点突变，缺失、插入，替换，修饰，融合等等，这样就存在成千 上万种可能，而又无从下手。除了酶，其他蛋白药物同样需要通过突变改造来进行优化，以 增加药物的稳定性或者产量。 还有更棘手的情况， 比如是蛋白质药物中的某些蛋白序列产生 了突变，即使是很少量的突变也可能造成生物活性的改变而增加免疫反应的发生几率。 为了弥补传统蛋白质鉴定方法在未知蛋白质序列和突变分析上的不足， 才促生了蛋白从头测 序这一新技术。 分析流程 蛋白从头测序流程（图片来源：百泰派克） 1.用蛋白酶对蛋白质样品进行多重酶切 2.用高效液相色谱仪（如 Obitrap Fusion Lumos ）对纯化后的酶切片段进行一系列质谱分析， 得到无偏差准确序列 3.对得到的无偏差准确序列进行质谱鉴定 4.使用 MassAnalyzer 进行序列反向验证 技术优势 以百泰派克生物提供的全新一代蛋白从头测序平台为例， 介绍此技术相对于传统测序方法的 优势。 可实现蛋白全序列覆盖。 通过利用多种酶对样品进行酶切， 不同酶切肽段之间的互补性能实 现蛋白分子 100%全序列的拼接。 数据处理算法先进。百泰派克基于发表在 Nature Biotechnology 和专业的蛋白组学杂志 JPR 上的文献，结合现有的专业蛋白序列分析软件 PEAKS Mass Spectrometry Software，开发了自 己的质谱原始数据计算方法， 采用宽进窄出的原则， 在不遗漏任何有效数据信息的同时实现 了蛋白序列的准确分析。 测序过程中使用高分辨率和高灵敏度的 Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪，与老一代的质谱仪 （例 如 Obitrap Elite 、Q Exactive 等）相比， Lumos 在提高了一级二级质谱扫描速度的同时保证肽 段分子量的准确性；一级质谱扫描速度的提高，有助于同一个肽段可以更多次的被鉴定到， 提高了结果的可信性；二级质谱扫描速度的提高可以更好的进行片段碎裂（如下图所示）， 从而保证结果的准确性， 并可以通过二级碎裂片段的特征峰实现亮氨酸和异亮氨酸的准确判 定。 序列预测和严格的序列验证严谨。 百泰派克对测序的结果会首先进行序列的