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以乳糖为诱导剂的高密度发酵 - 褚仲梅 中国医药工业杂志　ChineseJournalofPharmaceuticals2001,32(11) ?491? 文章编号: 1001-8255(2001)-0491-03 以乳糖为诱导剂的高密度发酵 褚仲梅1,　申秀云1,　刘现杰2,　屈贤铭1 (1.上海生物工程研究中心,上海200233;2.珠海亚利生物工程有限公司,珠海519000) 摘要:以重组刺桐胰蛋白酶抑制剂(rETIa)为目的产物,用摇瓶比较了以异丙基-半乳糖苷和乳糖诱导表达的差β-D-异,并在15L发酵罐中,以乳糖为诱导剂进行高密度发酵,摸索了诱导后碳、氮补加工艺对产物表达的影响,成功地使菌体密度达到61(A600),表达量达到菌体总蛋白的33%,为乳糖替代IPTG在工业生产中应用提供了借鉴。关键词:乳糖诱导;高密度发酵;重组刺桐胰蛋白酶抑制剂中图分类号:TQ925　　　文献标识码:A 随着生物技术的发展,许多基因工程重组蛋白 在大肠杆菌表达系统中进行表达生产。lac及其衍生的启动子被广泛地应用在该领域中,通常这类启动子都用异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,进行诱导外源蛋白的表达,但IPTG成本高并污染环境,不适于工业生产。国外有以乳糖替代IPTG发酵的文献报道 [1～4] 1.4　培养基 LB固体平板培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10,氨苄青霉素0.1,琼脂粉20;pH7.0。 LB液体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10,氨苄青霉素0.1;pH7.0。 发酵罐培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉10,NaCl4,NH4Cl15,KH2PO42.67,Na2HPO4?12H2O5.3,氨苄青霉素0.1;消泡剂0.2ml;pH7.0。 发酵罐补料: 补氮培养基(g/L):蛋白胨200,酵母粉100。补糖培养基(g/L):葡萄糖500,MgSO4?7H2O3。诱导乳糖培养基(g/L):乳糖333,MgSO4?7H2O1.5。 ,我们在长期中试工作的基础上, 以重组刺桐胰蛋白酶抑制剂(rETIa)为目的产物,用乳糖诱导lac启动子表达T7mRNA聚合酶,再 由T7mRNA聚合酶诱导T7启动子表达rETIa,摸索了以乳糖代替IPTG诱导重组蛋白的发酵工艺。通过努力,基本能用乳糖完全代替IPTG,并达到相当的效果,已成功地应用于本研究室和公司的协作项目中。1　材料与方法1.1　菌种 重组大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和质粒PET-22b,由日本Kyushu大学YoshiakKouzuma博士惠赠。 [5] 1.5　摇瓶及发酵罐培养方法1.5.1　摇瓶培养 取于-70°C保存的甘油菌种,于LB平板上划 出单菌落,将单菌落接种于LB试管中,37°、250Cr/min培养过夜,1%接种于摇瓶(LB装量为50ml/250ml瓶),37°C、250r/min培养约2h至A600约为0.5,共作四份,分标示A、B、C、D。A瓶加1mmol/LIPTG诱导,B瓶加1mmol/LIPTG和1%葡萄糖诱导,C瓶加2%乳糖诱导,D瓶为对照品。其后不同时间取样进行电泳,测定其表达量。1.5.2　发酵罐培养 将试管培养过夜菌1%接种于LB三角瓶(LB装量为100ml/500ml瓶)中,37°、250r/min培养C9h,5%接种于发酵罐。发酵罐起始装料6L。在乳糖诱导前期,流加葡萄糖,发酵6h之后,停止流加,待溶氧量迅速上升后开始乳糖诱导,方法1～3的各罐工艺如表1所示,在不同的时间补加乳糖和氮源,整个过程用2mol/LHCl和2mol/LNaOH控制pH7.0左右。 1.2　试剂 酵母粉为Oxoid产品,蛋白胨由日本制药株式会社提供,IPTG购自上海皓嘉科技发展有限公司。 1.3　主要设备仪器 G25-KC旋转式摇床(美国NewBranswickScientificCo.Inc.);DU7500分光光度计(美国Beckman公司);Mod-el200/2.0电泳仪(美国Bio-RAD公司);UltroscanXLEn-hancedLaserDensitometer电泳扫描仪(美国Pharmacia公司);15L发酵罐(德国BBraun公司)。 收稿日期:2001-04-03 作者简介:褚仲梅(1964),女,高级工程师,主要从事发酵工艺研究工作。 Tel:021353 ?492?