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真菌杀灭试验 2.1.1.9.1 目的 在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌孢子 所需剂量，以验证对真菌及其孢子实用消毒剂量。 2.1.1.9.2 试验器材 (1) 麦芽浸膏琼脂（ MEA）：见附录 A。 (2) 沙堡琼脂培养基：见附录 A。 (3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备 白色念珠菌 ATCC 10231 和黑曲霉菌 ATCC 16404 或孢子悬液与菌片 按 2.1.1.9.3(1) 和 2.1.1.9.3(2) 所示方法制备。 此外，根据消毒剂特定用途和特殊需要，可选用其它真菌或 孢子悬液与菌片。 （4 ）中和剂 ( 根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者 ) 。 （5）磷酸盐缓冲液 ( PBS ， 0.03 mol/L ，pH7.2) 。 （6）消毒剂稀释用硬水：见附录 A。 （7）有机干扰物质：见附录 A。 （8）刻度吸管 (0.1ml 、1.0ml 、5.0ml) 。 （9）恒温水浴箱。 （10）喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。 （11）电动混合器。 （12）计时装置。 2.1.1.9.3 真菌悬液制备 （1）白色念珠菌悬液的制备 1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量沙堡液体 培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0ml ～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h ～24h。 用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板 上，于 37℃ 培养 18h ～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落， 接种于沙堡琼脂斜面， 于 37℃ 培养 18h ～24h，即为第 3 代培养物。 将其密封后在 4℃保存，时间不得超过 6 周。 2）试验时，取第 3 代斜面培养物在砂堡琼脂斜面上连续传代，方法 与第 3 代相同。取第 5 代或 6 代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物 （18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0ml ～5.0ml 稀释液加入斜面 试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另 一无菌试管中，用电动混合器混合 20s，或在手掌上振敲 80 次，以 使白色念珠菌菌悬浮均匀。 7 3）悬液杀菌试验时，实验用菌悬液的含菌量为 1×10 cfu/ml ～ 7 5 ×10 cfu/ml ；菌片制备按 2.1.1.2 要求进行。 4 ）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。 5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴 定。菌落形态可直接用显微镜观察。 菌体形态可在涂片后直接用高倍 显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀， 推成薄膜）后观察。 （2）黑曲霉 ATCC 16404 悬液或菌片的制备。 1) 取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细管吸取少量麦芽浸膏肉 汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许 沉淀物悬液加到含 5.0ml 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置 30℃± 1℃培养 42h～48h。用接种环划线接种第 1 代培养物于 MEA培 养基平板，置 30℃±