实验四-逆转录pcr-(rt-pcr).docxVIP

【实验目的】 了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。 学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应(PCR)过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为 上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因 的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106倍。RT-PCR将以RNA为模 板的 cDNA (complement DNA)合成(即 RNA 的反转录(RT, reversetranscription)),同 cDNA 的 PCR 结合在一起的技术，提供了 一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于cDNA包括 了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此 RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病 毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原 位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的基本原理(图)。首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA,即总RW中的mRNA 在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的