生化技术线粒体提取.pptxVIP

植物线粒体的制备与活性测定;一、实验目的 1．建立生物活体的概念 2．明确分离、提取亚细胞的原理，掌握方法，特别是实验的关键点 3．掌握酶活性测定的原理和方法 4．做到举一反三;ATP;2.制备方法;3.材料 本次使用绿豆芽。植物的各个部分都可用来制备线粒体，但应该避免那些组织坚实、细胞壁老化及含叶绿体的材料。最好采用黄化幼苗或贮藏组织。用作制备线粒体的材料应该是新鲜、生长势旺盛。 ;4、线粒体的检查 （1）光学显微镜观察 将线粒体悬浮液用Janus Green-B（詹纳斯绿-B）染色后观察，线粒体被染为绿色。 （2）磷酸钨负染色 线粒体悬浮液用磷酸钨染色后用电子显微镜观察线粒体结构的完整性以及污染情况。 （3）分光光度法 在520nm下测定光密度（O.D），看线粒体是否膨胀。 ;4.注意事项 制备植物线粒体最大的困难是随着组织的破坏，常伴随有线粒体膨胀和由于内源脂肪酸、酚类、醌类物质所引起正常线粒体机能的抑制。所以制备时要求： （1）溶剂系统必须要维持一定的渗透压。一般使用的是甘露醇或蔗糖。 （2）加螯合剂或巯基化合物去除酚类化合物的毒害。 （3）加入牛血清抑制游离脂肪酸或其它脂类物质的毒害。 （4）根据不同材料确定不同的缓冲系统。;介质中，常含有： ① 0.25-0.4mol/L蔗糖或甘露醇，使与细胞溶液成等渗的； ②