PikoReal使用培训-致病菌检测.ppt

PikoReal 荧光定量PCR使用培训 － 致病菌检测;内容： 1、荧光定量PCR基本原理介绍 2、PikoReal 功能简介 3、致病菌检测实验操作及结果分析 ; PCR和定量PCR —— 基本知识介绍;生命的遗传物质DNA（少数物种为RNA），对于不同的物种来说，其碱基排列顺序是独一无二的 检测不同生物中特异的DNA片段，就可以清楚的区分不同的生物。 ;中心法则;Polymerase Chain Reaction（PCR） ——聚合酶链式反应 ;;PCR的基本原理;??PCR反应过程中，升温，降温交替进行，循环往复 —— 热循环 提供热循环环境的仪器 —— 热循环仪（PCR仪）;模板（DNA or RNA） DNA：从 animal, plant, bacteria, yeast, virus中抽提 RNA：抽提后逆转录为cDNA(也在PCR仪上完成） 引物（一对或多对） 脱氧核糖核苷酸 (dNTP原料) 热稳定的DNA聚合酶 Buffer （缓冲液提供适合的酶作用环境） 反应体系：5 - 50ul （常用） ;PCR的基本原理;PCR的基本原理;两种产物; PCR是当今应用最广泛的生物技术之一 几乎所有的分子生物学实验室，药物研发中心，临床诊断实验室都在使用PCR技术，而且还有新的应用方向不断开发出来 几个重要的应用领域: 科学研究 医学研究及诊断 法医鉴定 食品检验 ; ; ; ;光源;在体系中原料充足的情况下，产物按固定倍数呈指数增长 指数增长期间，初始模板浓度不同的样品的扩增曲线彼此平行;区别： 普通PCR：可以粗略定出反应结束时终产物的量- 半定量 荧光定量PCR仪：可以精确测量出初始模板量 ;荧光定量PCR —— 荧光染料和探针;;;融解曲线分析（Tm）;非特异性荧光染料 – SYBR- Green;;特异性荧光探针 – Taqman probes ; 致病微生物： 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单核细胞增生李斯特氏杆菌 肠毒素大肠杆菌 阪崎肠杆菌 弯曲杆菌（禽类） 肉毒梭菌 志贺氏菌 小肠结肠炎耶尔森菌、 霍乱弧菌 副溶血弧菌 创伤弧菌等 均能把3-5天的检测时间缩短到一天之内 ;; PikoReal 功能简介 ;研发生产中心：位于芬兰Espoo; 光源: 5x LED 寿命长，终身无需更换，为qPCR实验提供持续，稳定的激发信号 无需使用ROX染料进行光强校正 探测器：CCD 相机 能同时快速收集整板多重荧光信号数据 高灵敏度 PCR模块：96孔半导体PCR ;功能：;五通道四色：;仪器特点： 1、硬件组合优越，设计创新 2、更加适合5-10ul小反应体系，成倍节省实验成本 3、小巧、快速、稳定、安静无声; 致病菌检测实验操作及结果分析 ;检测流程;检测项目 ;2、细菌裂解，配制反应液及上样;检测试剂开放，可选择各国产及进口厂家试剂盒; 以金黄色葡萄球菌的检测为例; 以金黄色葡萄球菌的检测为例;3、梯度标准品配制 A、内部对照：取内部对照品4ul，加36ul水，震荡混匀后，3000rmp离心10秒，备用。 B、10倍稀释标准品（如只需出阴阳性结果，则无需配制系列浓度的阳性标准品） 1）取4只2ml离心管，分别标记为：2、3、4、5 （浓度依次为：5×106 、 5×105 、 5×104 、 5×103 拷贝/ml) 。 2）各管中分别加入36ul水 3）取4ul 阳性对照品加入1号管中，震荡混匀后取4ul加入2号管，2号管震荡混匀后取4ul加入3号管。依此处理4号管。 ;4、反应液配制1（绝对定量法用) 计算所需各反应液成分，按下表量加入2ml离心管，震荡混合均匀 绝对定量标准品 ：5 (5个浓度，可定量出未知样品拷贝数） 阴性对照：1 未知样品：n （n为未知样品数） ;4、反应液配制1 (阴阳性判定法用) 计算所需各反应液成分，按下表量加入2ml离心管，震荡混合均匀，3000rmp离心10秒，备用。 绝对定量标准品 ：1 (1个浓度，作为阳性参照） 阴性对照：1 未知样品：n （n为未知样品数） ;5、上样 A、取一片96孔Piko板，放入上样辅助仪，每孔加入反应液18ul B、取裂解的样品，加入un 孔，每种样品1孔；取稀释号的标准品，依次加入最后一列的孔中。在0孔中加入2ul水。 ;6、覆膜，离心，放入qPCR; 7、设置程序，点击Run启动PCR反应;2、点击New，新建一个运行文件，点击Proto